非小細胞肺癌組織錯配切除修復蛋白1、核苷酸還原酶M1和乳腺癌易感基因1的表達與預后的關系

楊 明，邢 坤，袁五營，杜佳輝，白 楊

(1.河南省周口市第五人民醫院，河南 周口 466000；2.河南省胸科醫院，河南 鄭州 450000；3.陜西省榆林市中醫醫院檢驗科，陜西 榆林 719000)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者接受外科手術進行治療后能夠有效延長其生存期，但部分患者經根治術治療后預后仍不樂觀，NSCLC患者根治術后3年生存率為53.8%[1]。為改善NSCLC患者的治療，發現簡便的預后指標對于改善治療決策至關重要[2]。有研究顯示，錯配切除修復蛋白1(Excision repair cross complement 1，ERCC1)、核苷酸還原酶M1(ribonucleotide reductaseM1，RRM1)可識別和切除修復損傷基因片段，通過影響核苷酸切除修復途徑參與癌癥進程，抑癌基因乳腺癌易感基因1(Breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)也可通過DNA調控通路提高細胞修復DNA損傷的能力，與癌癥進程密切相關，故上述三者均可初步預測癌癥患者的生存趨勢[3]。BRCA1在乳腺癌患者診治及預后預測中發揮重要作用[4]，但BRCA1 微小核苷酸(microRNA，mRNA)表達變化與NSCLC的關系仍有探討之處。本研究回顧性分析肺癌組織中ERCC1、RRM1、BRCA1表達及其與預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料2014年1月至2016年1月在河南省周口市第五人民醫院行肺癌根治術的72例NSCLC患者，納入標準：①影像學檢查、病理學檢查確診為NSCLC者；②均接受肺癌根治術者；③術前無放化療等其他抗癌治療者；④術后接受規律隨訪者。排除標準：①術后病理確診為小細胞肺癌者；②合并其他全身性疾病、其他惡性腫瘤者。本研究經醫院倫理委員會審核通過。所有患者均隨訪3年。

1.2 方法免疫組化法：切片脫蠟水化后抗原修復10 min；滴加適量的血清封閉液，在室溫下孵育30 min；分別滴加適當稀釋后的ERCC1、BRCA1、RRM1一抗(abcam公司)，4 ℃過夜；37 ℃復溫后滴加二抗，37 ℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復染，1%鹽酸酒精分化沖洗；脫水、透明、封片。實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)：Trizol法(美國Invitrogen公司)提取總RNA，逆轉錄成cDNA(日本Takara公司)，進行PCR檢測。引物(上海生工生物公司合成)序列見表1，PCR反應：94 ℃ 3 min(預變性)、94 ℃ 30 s(變性)、53.8 ℃ 30 s(退火)，72 ℃ 30 s(延伸)，變性、退火30次，72 ℃延伸5 min。以β-actin為內參，miRNA的相對表達量表示為2-ΔΔCt。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.3 評估標準[6]每張切片隨機觀測5個高倍視野(×400)，根據陽性細胞占比及染色強度進行評分[5]，RRM1、ERCC1染色強度分別計分1～3分，陽性細胞占比分別計分1～3分，總分=陽性細胞占比得分×染色強度得分，總分≥4分為陽性，<4分為陰性。BRCA1陽性染色為細胞質中出現淺黃色至棕褐色顆粒，染色強度分別計分0～3分，陽性細胞占比分別計分0～3分，總分=陽性細胞占比得分×染色強度得分，總分≥3分為陽性，<3分為陰性。

1.4 統計學方法應用SPSS 22.0軟件分析數據。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以n(%)表示，組間比較采用χ2檢驗；采用K-M法繪制生存函數曲線，Log-Rank法比較生存期；檢驗水準ɑ=0.05。

2 結果

2.1 肺癌組織免疫組化結果肺癌組織免疫組化圖中可見ERCC1、RRM1、BRCA1在細胞核中均呈現棕黃色顆粒(圖1)。

圖1 肺癌組織ERCC1、RRM1、BRCA1免疫組化圖(蘇木素-伊紅染色法，×400倍) a：ERCC1陽性；b：RRM1陽性；c：BRCA1陽性

2.2 肺癌及癌旁組織ERCC1、RRM1、BRCA1蛋白表達及BRCA1 mRNA相對表達量比較癌組織ERCC1、RRM1、BRCA1表達陽性率及BRCA1 mRNA相對表達量均高于癌旁組織(P<0.05)，見表1。

表1 肺癌及癌旁組織ERCC1、RRM1、BRCA1蛋白表達及BRCA1 mRNA相對表達量比較

2.3 ERCC1、RRM1、BRCA1陽性、陰性者及BRCA1 mRNA表達量高低者臨床病理資料比較以BRCA1 mRNA表達量的中位數(1.10)為界，將72例NSCLC患者分為高表達32例(>1.10)和低表達40例(≤1.10)。淋巴結轉移率比較：ERCC1陽性>ERCC1陰性、RRM1陽性>RRM1陰性、BRCA1 mRNA高表達>BRCA1 mRNA低表達(P<0.05)。見表2。

表2 ERCC1、RRM1、BRCA1陽性、陰性者臨床病理資料比較 [n(%)]

2.4 不同ERCC1、RRM1、BRCA1表達情況的NSCLC患者3年生存情況比較3年總生存率、3年無病生存率、中位生存期比較，ERCC1、RRM1陽性者均低于陰性者，BRCA1 mRNA高表達者均低于低表達者(P<0.05)，見表3。

表3 不同ERCC1、RRM1、BRCA1表達情況的NSCLC患者3年生存情況比較

2.5 ERCC1、RRM1、BRCA1陽性與陰性者及BRCA1 mRNA高表達與低表達者生存期比較生存期比較：ERCC1陽性0.05)。見圖2～圖5。

圖2 ERCC1陽性與陰性者生存期比較

圖3 RRM1陽性與陰性者生存期比較

圖4 BRCA1陽性、陰性者生存期比較

圖5 BRCA1 mRNA高表達與低表達者生存期比較

3 討論

除外科手術外，放化療等內科治療方法也是治療肺癌的重要方法。其中鉑類藥物在NSCLC化療中應用較多，但DNA修復的能力、轉運蛋白的活性及代謝相關基因多態性等均會影響NSCLC鉑類藥物化療效果[7]。已有部分相關報道顯示，鉑類化療方案的療效與DNA修復相關的ERCC1、BRCA1表達密切相關[8]。故RRM1、ERCC1表達水平可能通過影響NSCLC患者化療效果，影響患者預后情況。

本研究結果提示NSCLC中ERCC1、RRM1和BRCA1均趨向于高表達。ERCC1基因發生突變可導致ERCC1蛋白表達水平發生異常，異常激活核酸修復過程，導致正常肺組織細胞發生惡性轉化[9]。DNA損傷修復過程中的限速酶RRM1高表達時，惡性腫瘤細胞的增殖能力得到增強，有助于其遷移、侵襲及其耐藥性的增加[10]。此外，BRCA1也是調節DNA代謝和損傷修復的核酸分子[11]。故在肺癌組織中ERCC1、RRM1和BRCA1基因突變導致ERCC1、RRM1和BRCA1蛋白高表達，使正常細胞惡變和肺癌細胞增殖。本組數據顯示，ERCC1、RRM1蛋白高表達會使患者更易出現淋巴結轉移。通常而言，肺癌淋巴結轉移與其惡性程度和腫瘤大小相關[12]，與本研究結論不符。回溯研究數據可發現，本研究對象均為Ⅱ期以上NSCLC，且各蛋白表達陰性者均較少。但本研究結果顯示，NSCLC患者癌組織BRCA1 mRNA相對表達量更高。BRCA1是一種抑癌基因，但其氨基末端的1個鋅指結構域及羧基末端的2個串聯BRCT結構域發生突變后，會導致BRCA1錯位表達，促使其在NSCLC發生、發展過程中轉化為類似致癌基因的角色，導致細胞惡變[13]。

本研究結果顯示，NSCLC患者BRCA1 mRNA高表達者表現出更高的淋巴結轉移率。同時，本研究隨訪發現，ERCC1、RRM1蛋白表達水平和BRCA1 mRNA相對表達量與NSCLC患者預后情況關系緊密。術后輔助化療有利于清除根治術后機體殘存惡性腫瘤細胞，改善患者預后。鉑類藥物治療機制是藥物在細胞中水解轉變為雙氯雙氨鉑作用于DNA，交叉聯結形成DNA-鉑類復合物，破壞了DNA分子的結構，擾亂DNA的復制、轉錄，導致DNA鏈合成終止，誘導腫瘤細胞受損壞死[13]。但ERCC1、RRM1、BRCA1各蛋白過表達會增強腫瘤細胞的DNA損傷修復機能，使鉑類化療藥物產生抗藥性，同時也會增強腫瘤細胞增殖活性機能，使腫瘤更易生成微轉移病灶，出現轉移復發，導致不良預后。

綜上所述，肺癌組織中ERCC1、RRM1和BRCA1均高表達，ERCC1、RRM1蛋白陽性與BRCA1 mRNA高表達會影響NSCLC患者淋巴結轉移，且能在一定程度上預測患者預后情況。