PM2.5暴露后激活核轉錄因子/環氧化酶2/前列腺素E2信號通路引起氧化應激損傷雄性生殖功能的機制研究

劉津念，鄭 劍，殷永健，張正紅，盛 夏，唐 偉

(1.重慶市巴南區第二人民醫院泌尿外科，重慶 400054；2.重慶醫科大學附屬第一醫院泌尿外科，重慶 400016)

不育是威脅人類生殖健康的全球性難題[1，2]。以大氣顆粒物(PM)為特征的大氣復合污染物暴露對健康有直接或間接影響，尤其是對生殖系統的影響也開始受到人們關注[3]。研究表明[4]，大氣細顆粒物(PM2.5)對男性生殖系統有嚴重深遠影響。前列腺素E2(PGE2)為花生四烯酸經環加氧酶催化的代謝產物，是重要炎癥因子，COX-2為PGE2生成的主要限速酶，核轉錄因子κB(NF-κB)信號通路則是體內一條非常經典信號通路，在細胞凋亡過程中發揮重要作用[5，6]，研究發現[7]，NF-κB/COX-2/PGE2與男性生殖功能受損有關。本研究探討PM2.5暴露后激活NF-κB/COX-2/PGE2信號通路引起氧化應激損傷雄性生殖功能的機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2019年11月至2020年11月于重慶醫科大學實驗動物中心、重慶醫科大學生命科學院開展實驗。選取20只清潔級別c57bl雄性小鼠，體重34～37 g[(35.48±1.27)g]。均于單籠飼養在18～21 ℃、濕度45%～60%環境中，實驗期間飼喂普通清潔級飼料，自由攝食飲水，在適應性飼養1周后開展實驗。主要試劑：DMEM/F12培養基(Hyclone公司)；胎牛血清(北京民海生物科技有限公司)；1∶250胰蛋白酶(北京聚合美公司)；膠原酶Ⅰ(Sigma公司)；考馬斯亮藍G250(Solarbio公司)；ELISA快速檢測試劑盒(Meimian公司)；AxyPrep總RNA小量提取試劑盒(Axygen公司)；RNase-free Water(北京TransGen Biotech公司)；兔抗NF-κB多克隆抗體(英國Abcam公司)；兔抗COX-2單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；兔抗PGE2單克隆抗體(英國Abcam公司)；兔抗β-actin多克隆抗體(美國Proteintech公司)。儀器：小動物手術器械及溶液配制容器、電子天平、超凈工作臺、CO2培養箱、恒溫水浴、離心機，均購自美國Thermo公司；光學顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標儀；qTOWER3 touch熒光定量PCR儀[中機科儀(北京)]。

1.2 方法

1.2.1分組及處理 采用隨機數字表以簡單隨機分組法將20只小鼠分為對照組和暴露組各10只，對照組留于SPF級動物中心飼養，實驗組在對照組基礎上注射24 mg/kg.b.w.PM2.5懸液予以PM2.5暴露，持續暴露12周。24 mg/kg.b.w.PM2.5懸液的制備：于重慶市區內露天環境中進行采樣，采樣時間為2019年11月至2020年5月，采樣儀器：Thermo Anderson大氣顆粒物采樣器(GV2630)，在采樣完成后，將玻璃剪碎成1.5 cm×1.5 cm小片，置于適量的生理鹽水中，以超聲振蕩器(KQ-250DE，中國舒美)超聲震蕩4×40 min，得到PM2.5懸液，以Thermo冷凍干燥機(LL3000，美國)凍干12 h，得到固體PM2.5，后儲存在-80 ℃冰箱中，使用前以無菌生理鹽水制成24 mg/kg.b.w.PM2.5懸液。

1.2.2標本取材及處理 各組小鼠處理結束后麻醉、處死，收集血液、睪丸、附睪等標本。每組各取出10個睪丸經Bouin液固定、脫水、石蠟包埋，用于免疫組織化學檢測；每組各取10個睪丸立即放入液氮凍存，用于基因和蛋白檢測；每組血液標本經離心處理用于ELISA檢測；附睪立即置于PBS緩沖液中，進行生殖功能檢測實驗。睪丸組織取出后放入4%多聚甲醛固定，室溫固定24 h，12 h取出睪丸并對切，充分固定，后予以梯度脫水、浸蠟、包埋處理。

1.3 觀察指標

1.3.1生殖功能檢測 主要包括睪丸與附睪指數、精子計數、精子活動率、精子畸形率、精子成活率，其中精子活動率檢測依據WHO推薦的方法，按照精子泳動圖將精子活動分為Ⅰ～Ⅳ級，精子活動率=(Ⅰ級+Ⅱ級+Ⅲ級)/(Ⅰ級+Ⅱ級+Ⅲ級+Ⅳ級)×100%。

1.3.2血睪屏障及間質細胞功能檢測 將考馬斯亮藍溶液沿著血管注射，肉眼觀察考馬斯亮藍在睪丸的通透情況并拍照，分析血睪屏障通透性；經免疫熒光組織化學法[8]檢測Sertoli細胞骨架Vimentin、Actin分布與形態變化，透射電子顯微鏡觀察生精細胞間緊密連接時空變化，觀察睪丸間質細胞結構。

1.3.3酶聯免疫吸附試驗 應用ELISA快速檢測試劑盒檢測各組小鼠睪丸組織勻漿和血清中睪酮(T)、雄性激素結合蛋白(ABP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)含量。

1.3.4NF-κB/COX-2/PGE2信號通路的檢測 實時熒光定量PCR法[9]測定睪丸組織NF-κB/COX-2/PGE2 mRNA的表達，反應體系：正義鏈(F)1 μl+反義鏈(R)1 μl+Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2X)，no ROX 12.5 μl+模板4 μl，加水至25 μl。擴增條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環；72 ℃ 5 min。采用ΔΔCt法進行計算，相對表達量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=[Ct GI(未知樣本)-Ctβ-actin(未知樣本)]-[Ct GI(校正樣本)-Ctβ-actin(校正樣本)]，其中GI為目的基因，β-actin為管家基因作為校正起始模板。Western blot法[9]測定睪丸組織NF-κB/COX-2/PGE2蛋白的表達情況。將少量組織(約0.1 g)放入無菌2 ml EP管中，添加組織裂解液1 ml及蛋白酶抑制劑10 μl，靜置，后勻漿、裂解組織、離心，采用BCA蛋白提取試劑盒進行檢測，后予以SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、抗原抗體反應，測3次取平均值。采用半定量評分系統評定效果。

1.4 統計學方法應用SPSS 23.0統計軟件進行數據處理。計量資料以均數±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗；計數資料以例數(百分率)表示，比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組生殖功能指標比較暴露組睪丸系數、附睪系數、精子計數、精子活動率與精子成活率低于對照組，而精子畸形率高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組生殖功能指標比較

2.2 考馬斯亮藍染色結果考馬斯亮藍染色發現，對照組(圖1a)淡染的睪丸支持細胞生長較均勻，自然伸展且相互連接，細胞骨架以縱向分布為主，呈均勻分布；暴露組(圖1b)細胞質骨架逐漸松弛回縮甚至斷裂、消失，分布紊亂，生精細胞脫落。

圖1 考馬斯亮藍染色結果(×200) a：對照組；b：暴露組

2.3 免疫組化染色結果免疫組化法發現，與對照組(圖2a)相比，暴露組(圖2b)睪丸間質細胞體積變小，染色加深，細胞核固縮，胞漿含量少，少部分內質網出現水腫，細胞內異染色質增多。

圖2 免疫組化染色結果(×6000) a：對照組；b：暴露組

2.4 酶聯免疫吸附試驗檢測結果暴露組睪丸組織勻漿及血清中T、ABP表達水平低于對照組，而TNF-α、IL-1與IL-6水平高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 酶聯免疫吸附試驗檢測結果比較

2.5 兩組NF-κB、COX-2、PGE2表達水平暴露組NF-κB、COX-2、PGE2的mRNA表達水平及蛋白表達水平均高于對照組(P<0.05)。見圖3、表3、表4。

圖3 兩組NF-κB、COX-2、PGE2蛋白表達水平(Western blot法)

表3 兩組NF-κB、COX-2、PGE2 mRNA表達水平比較

表4 兩組NF-κB、COX-2、PGE2蛋白表達水平比較

3 討論

氧化應激是大氣顆粒物引起機體損傷的主要機制，而活性氧自由基(ROS)為正常有氧代謝過程中產生的有害副產物，顆粒物暴露能引起ROS增多破壞了這一平衡[10]。大氣顆粒物的細胞毒性主要機制為通過氧化應激產生，其中PM2.5可深入機體肺泡并沉積，對機體的呼吸系統造成損傷，也可激活相關通路引起睪丸組織發生氧化應激，造成精子質量損害，精子質量降低可能是因大氣細顆粒物暴露產生的氧化應激所致[11]。目前PM2.5對雄性生殖健康影響已引起關注，相關研究逐漸增多，但多數研究主要涉及一般生殖毒性指標的觀察[12，13]。NF-κB為一類關鍵性的核轉錄因子，通常以同源或異源二聚體非活性形式存在于幾乎所有類型細胞的胞質，COX-2也是重要的氧化應激相關因子，有研究發現[14]，NF-κB/COX-2途徑的解旋酶驅動激活介導人腫瘤微環境中dsRNA驅動的炎癥免疫抑制成分，而PGE2為花生四烯酸經環加氧酶催化的代謝產物，與多種疾病發生發展有關[15]，但PM2.5引起的氧化應激損傷及雄性生殖功能障礙是否與NF-κB/COX-2/PGE2信號通路有關目前未見報道。

精液液化時間、精液pH值、精子濃度、精子活力、正常形態率及異常形態率等精液參數均可作為男性不育的評估指標。本次發現，暴露組睪丸系數、附睪系數、精子計數、精子活動率、精子成活率低于對照組，而精子畸形率高于對照組，這與曹希寧[9]的研究有相似之處，表明PM2.5的持續暴露可能引起雄性大鼠生殖功能障礙。氧化應激可通過對雄性生殖系統的損傷而影響男性生育能力及對子代的表觀遺傳，表現為類固醇激素合成下調，最終影響雄性生育力及子代相關基因的表達[16]。PM2.5為環境空氣中空氣動力學直徑<2.5 μm的顆粒物，其面積較大，活性強，易于附帶有毒、有害物質等，同時可誘導睪丸組織產生過量ROS，導致機體氧化應激損傷，從而影響生殖功能[17]。

間質細胞為睪酮主要來源，能保證睪酮局部較高濃度，此為完成精子發生所必需的條件，支柱細胞Sertoli對卵泡刺激素(FSH)起反應，產生雄激素結合蛋白(ABP)、抑制素(inhibin)，并組成血睪屏障。本次考馬斯亮藍染色及免疫組化染色表明，PM2.5的長時間暴露可引起雄性小鼠睪丸間質細胞結構及血睪屏障，PM2.5暴露后可破壞正常的抗氧化防御系統，減少超氧化物歧化酶的含量，增加脂質過氧化物丙二醛含量，最終導致睪丸氧化應激及生殖功能不良發展[18]。此外本次暴露組睪丸組織勻漿及血清中T、ABP表達水平低于對照組，而TNF-α、IL-1、IL-6水平高于對照組，表明PM2.5暴露后可能引起全身炎癥反應，睪丸血管炎癥性病變，血睪屏障破壞，大量的炎癥因子進入睪丸，使之發生炎癥反應，從而影響生殖功能。

精子質膜富含的高濃度多不飽和脂肪酸對氧化損傷較敏感，質膜較容易因其受到破壞，此外精子細胞核缺乏對氧化應激的抵抗力，易受此影響而出現DNA損傷，而睪丸組織的氧化應激易造成精子質量損害。本次結果表明PM2.5暴露后引起雄性生殖功能損傷可能與上調NF-κB/COX-2/PGE2信號通路有關。NF-κB信號通路為體內一條非常經典的信號通路，其參與細胞增殖、凋亡、分化等相關基因表達調控[19]，PGE2不僅可直接刺激神經末梢引起疼痛，也能提高痛覺感受器對其他致痛因子的敏感性誘發P物質等釋放增加，COX-2為PGE2生成的主要限速酶[20]。Yin等[21]的研究表明，PM2.5可激活血管內皮細胞COX-2/PGES/PGE2的炎性軸，從而促進細胞凋亡和炎癥反應，本研究也得出的相似結論。我們推測PM2.5暴露后可引起全身炎癥反應，睪丸血管炎癥性病變，血睪屏障破壞，大量的炎癥因子進入睪丸，激活NF-κB/COX-2/PGE2信號通路，破壞Sertoli細胞功能，從而導致生殖細胞發育、分化為成熟精子障礙，進而引起精子數量和質量的異常，最終導致雄性不育。但本次研究條件有限，未對小鼠睪丸Sertoli細胞進一步進行分離培養觀察，后期將進一步開展體外實驗，深入探究PM2.5對NF-κB/COX-2/PGE2信號通路的影響。