血清微小RNA-21在腎移植術后并發急性腎損傷早期診斷中的應用價值▲

覃曉虹 劉志昂 陸婷婷 楊 溢 董建輝

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二三醫院1 檢驗科，2 移植科，廣西南寧市 530021，電子郵箱：499432680@qq.com)

腎移植術后急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)與移植腎的免疫損傷、缺血損傷等密切相關[1-2]。目前，臨床上一般通過監測患者術后血清肌酐水平的變化來預測是否發生腎移植術后AKI，然而當血清肌酐水平升高時，腎移植患者的腎功能可能已經呈嚴重減退狀態，這對患者的生命安全造成嚴重威脅[3-4]。因此，亟待尋找一種敏感性和/或特異性較強的腎移植術后AKI的早期診斷標志物。有研究發現，血清微小RNA(microRNA，miRNA)-21表達水平的變化與腎細胞的增殖及凋亡有關[5]。但目前關于miRNA-21在腎移植術后AKI早期診斷中的應用研究仍較少。因此，本研究探討血清miRNA-21在腎移植術后并發AKI早期診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月至2020年2月我院收治的84例腎移植受者作為研究對象。納入標準：(1)在我院接受規律血液透析治療1個月以上，且在我院接受腎移植術者；(2)AKI診斷符合《改善全球腎臟病預后組織臨床實踐指南》中相關標準[6]；(3)入組患者均對本研究知情同意。排除標準：(1)接受2次以上腎移植受者；(2)臨床資料不全者。根據患者術后是否發生AKI分為AKI組和非AKI組，每組42例。AKI組男性27例、女性15例，年齡18～57(33.16±2.87)歲。非AKI組男性24例、女性18例，年齡17～59(32.37±4.15)歲。另選取同期在本院體檢的42例健康者作為對照組，男性25例、女性17例，年齡20～61(34.09±5.12)歲。3組研究對象的性別、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究通過本院醫學倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集：分別采集研究對象空腹靜脈血3 mL，2 500 r/min離心15 min分離血清，置于-80℃保存待檢。腎移植患者于腎移植術后第2天、對照組于體檢當日采集。

1.2.2 儀器與試劑：ViiA 7型實時熒光定量PCR儀、TRIzol(批號：181203)及逆轉錄試劑盒(批號：1948302)由Life Technologies公司提供，Versa Fluor比色杯熒光分光光度計由Bio-Rad公司提供，AU680全自動生化分析儀購自美國貝克曼庫樂特公司。miRNA-21引物及內參U6由上海生工生物工程公司合成，miRNA-21上游引物序列為：5′-AGCAAGUCUGAGUACUGAUGCAGUGCAUCAUGUCACCGUUGCAU-3′，下游引物序列為：5′-ACAAAUCGACUUGCAUCGCCUGU-3′；內參U6引物序列為：5′-TCTCGCTCGCACGCAGA-3′(正向)，5′-TAACGCTCACAATTTGCGGT-3′(反向)；miRNA-21逆轉錄引物序列為：5′-CUCGUGAUUUACUGGCCCCUGCUCGAGAGAUGAGGAUAACUAGCACUGAGCCA-3′；內參U6逆轉錄引物序列為：5′-CTTGCGCGGAATAGCTTCTTCAT-3′。

1.2.3 檢測方法：(1)血清總RNA提取。參照TRIzol試劑盒說明書操作，檢測樣本中RNA濃度及純度。(2)逆轉錄反應。參照逆轉錄試劑盒說明書操作，反應體系為20 μL，包括2 μL RNA樣品、1 μL引物、1 μL逆轉錄酶、1 μL U6反向引物、0.5 μL RNase 抑制劑、1 μL dNTP 混合物(10 mM)、4 μL 5×RT 緩沖液、9.5 μL不含RNase的H2O 。反應條件為42℃ 30 s，92℃ 10 min，65℃ 30 s，32℃ 1 min，產物置于-20℃保存。(3)PCR擴增。采用實時熒光定量PCR儀進行擴增，反應體系共25 μL，包括2 μL稀釋的cDNA、12.5 μL SYBP Premix EX TaqTMⅡ、2 μL引物、8.5 μL ddH2O。反應條件為30℃ 5 min，42℃ 10 min，85℃ 30 s，45℃ 1 min，40個循環。(4)結果分析。miRNA-21的相對表達量=2-ΔΔCt值(miRNA-21)-2-ΔΔCt值(U6)。(5)檢測血清肌酐、尿酸、降鈣素原及尿素氮水平。血清肌酐正常值：男性54～106 μmol/L，女性44～97 μmol/L；血清尿酸正常值：男性237.9～356.9 μmol/L，女性178.4～297.4 μmol/L。血清降鈣素原正常值：0.15～14 ng/mL；血清尿素氮正常值：3.10～8.80 mmol/L。計算腎小球濾過率，男性腎小球濾過率(mL/min)=[(140-年齡)×體重(kg)]/血肌酐(μmol/L)×1.23，女性腎小球濾過率(mL/min)=[(140-年齡)×體重(kg)]/血肌酐(μmol/L)×1.04。腎小球濾過率正常值：90～125 mL/min。

1.3 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗；計數資料以例數(百分比)表示，比較采用χ2檢驗；采用Pearson法進行相關性分析，采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析血清miRNA-21預測腎移植后AKI的臨床價值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組研究對象血清miRNA-21相對表達量的比較 AKI組、非AKI組、對照組的血清miRNA-21相對表達量分別為(3.51±0.98)、(1.13±0.27)、(1.04±0.19)，3組比較差異有統計學意義(F=231.196，P<0.001)，其中AKI組的血清miRNA-21相對表達量均高于非AKI組與對照組(均P<0.05)，而非AKI組與對照組的血清miRNA-21相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 AKI組和非AKI組實驗室相關檢測指標的比較 術后第2天，AKI組患者的血清肌酐、尿酸、降鈣素原及尿素氮水平均高于非AKI組，而腎小球濾過率低于非AKI組(均P<0.05)，見表1。

表1 AKI組和非AKI組實驗室相關檢測指標的比較(x±s)

2.3 腎移植患者血清miRNA-21相對表達水平與腎損傷指標的相關性 由Pearson分析結果可知，腎移植患者血清miRNA-21相對表達水平與血清肌酐、尿酸、降鈣素原及尿素氮均呈正相關(均P<0.05)，見表2。

表2 血清miRNA-21與腎損傷指標的相關性

2.4 血清miRNA-21相對表達量對腎移植后AKI的預測價值 ROC曲線分析結果顯示，血清miRNA-21相對表達水平預測腎移植后AKI的曲線下面積為0.875(95%CI：0.834，1.971，P<0.001)，約登指數為0.754，敏感度為91.04%，特異度為86.17%，見圖1。

圖1 血清miR-21NA相對表達水平預測腎移植后并發AKI的ROC曲線

3 討 論

腎移植是大多數終末期腎臟疾病患者的理想治療方式，但移植術后患者往往并發腎損傷，影響移植腎功能的恢復[7-8]。目前，臨床上一般根據患者術后尿量、血清肌酐、尿素氮等指標評價患者移植腎功能，但上述指標的診斷敏感性和特異性均較低，影響患者的病情評估[9]。既往研究顯示，miRNA與狼瘡性腎炎、糖尿病腎病、IgA腎病等腎臟疾病相關[10],而miRNA-21位于17q23.2染色體上，其表達與腫瘤、腎臟、心血管等疾病有關[11-12]。本課題組前期研究發現，腎移植術后并發AKI患者術后1～3 d的血清miRNA-21表達水平均高于腎移植術后無AKI患者。本研究結果也顯示，AKI組的血清miRNA-21相對表達量高于非AKI組與對照組(P<0.05)，而非AKI組與對照組的血清miRNA-21相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)，提示miRNA-21在腎移植術后并發AKI患者血清中呈高表達。鐘開義等[13]研究發現，miRNA-21在AKI患者血清中的表達水平明顯升高，可能可以作為診斷AKI的生物學標志物。相關動物實驗表明，miRNA-21可調控腎臟缺血再灌注損傷大鼠的腎小管上皮細胞壞死及凋亡[14]。由以上結果推測，miRNA-21可能來源于受損腎組織，故腎移植術后并發AKI患者的血清miRNA-21表達上調。

本研究結果顯示，AKI組患者的血清肌酐、尿酸、降鈣素原及尿素氮水平均高于非AKI組，腎小球濾過率低于非AKI組，且血清miRNA-21相對表達量與血清肌酐、尿酸、降鈣素原及尿素氮均呈正相關(均P<0.05)，提示血清miRNA-21表達量與腎移植術后并發AKI患者腎損傷的嚴重程度有關。林建等[15]的研究表明，miRNA-21在AKI患者血清中表達升高，可作為患者預后的評價指標。本研究ROC曲線分析結果顯示，血清miRNA-21相對表達水平預測腎移植術后并發AKI的曲線下面積為0.875，約登指數為0.754，敏感度為91.04%，特異度為86.17%，說明血清miRNA-21表達量對預測腎移植術后并發AKI具有重要價值，可作為預測腎移植術后并發AKI的評價指標。曹李娜等[16]的研究也發現，miRNA-21診斷心臟介入術后并發AKI的特異度較高，可作為AKI診斷的生物學標志物。

綜上所述， miRNA-21在腎移植后并發AKI患者血清中呈高表達，其與患者病情嚴重程度密切相關，或可作為腎移植后并發AKI的早期診斷指標。由于本研究納入的樣本量有限，研究結果存在一定局限性，今后需加大樣本量，深入探討miRNA-21表達量影響腎移植后并發AKI的機制。