抗逆轉錄病毒治療對HIV-1感染者外周血CD19+B淋巴細胞的活化與凋亡的影響▲

李建明 熊潤松 彭麗珊 王登嶸 楊 洋 劉 顯 伍月榕 梁镕伊 梁淑家 肖 健,5

(廣西中醫藥大學1 免疫學教研室，2 公共管理學院，南寧市 530020，電子郵箱：747110356@qq.com；3 重慶市武隆區疾病預防控制中心地方病與慢性病健康教育科，重慶市 408500；4 廣西壯族自治區疾病預防控制中心艾滋病防制科，南寧市 530000；5 廣西中醫藥大學廣西高發傳染病中西醫結合轉化醫學重點實驗室，南寧市 53022)

AIDS是由HIV-1感染所致，HIV-1入侵宿主后導致CD4+T淋巴細胞、單核巨噬細胞和B淋巴細胞等多種細胞的免疫應答失調[1-3]，且能在外周血和淋巴組織中檢測到這些異常應答。HIV-1直接或間接地作用于免疫系統，進行性破壞免疫系統[4]，使得CD4+T淋巴細胞數量降低、功能缺陷，進而影響B淋巴細胞的活化及抗體的分泌，導致免疫系統功能失調[5]。HIV-1為逆轉錄病毒，因此抗逆轉錄病毒治療(antiretroviral therapy，ART)可極大程度地抑制HIV的復制，同時抗逆轉錄病毒藥物的聯用也對HIV的復制造成多重的障礙。CD19廣泛表達于大多數B淋巴細胞，是B淋巴細胞受體識別抗原中關鍵的信號傳遞分子，也是B淋巴細胞表面的特異性標志，是參與B淋巴細胞活化、增殖、分化及抗體產生的重要膜抗原。目前，探討外周血CD19+B淋巴細胞的免疫活化和耗竭與HIV-1感染進程相關性的研究較少。本研究應用流式細胞術檢測CD19+B淋巴細胞活化指標CD38、耗竭指標CD95和程序性死亡受體1(programmed cell death 1，PD-1)的表達情況，分析在HIV-1感染過程中CD19+B淋巴細胞的活化和耗竭情況，探討ART對HIV-1感染者CD19+B淋巴細胞水平及其CD38、CD95和PD-1水平的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2016～2018年在廣西疾病預防控制中心就診的101例HIV-1感染者為研究對象，年齡7～86歲，中位年齡39歲，其中男性78例、女性23例。納入標準：感染至納入研究時間不超過10年，CD4+T淋巴細胞計數<350個/μL。排除合并HBV、HCV感染。根據是否進行過ART，分為未治療組73例(無特殊病史，體檢顯示無其他異常)和治療組28例。未治療組中男性61例、女性12例，年齡(37.45±15.65)歲；治療組中男性17例、女性11例，年齡(33.39±15.38)歲。另設健康對照組30例，納入標準：HIV-1陰性，身體健康，無疾病史、過敏史及免疫治療史。排除合并HBV、HCV感染。其中男性12例、女性18例，年齡12～80(31.43±12.40)歲。3組研究對象的年齡和性別構成等一般資料比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究獲得廣西中醫藥大學醫學倫理學委員會批準，所有研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑 流式細胞儀購自美國BD公司(型號：CytoFLEX)，臺式水平離心機購自德國Eppendorf公司(型號：AG5453)。人淋巴細胞分離液購自Solarbio公司(生產批號：P8610)，RPMI-1640培養基購自Solarbio公司(生產批號：11875)，磷酸緩沖鹽溶液購自Solarbio公司(生產批號：1020)，流式抗體Anti-Human CD19 APC-Cy7(生產批號：557791)，Anti-Human CD38-PerCP-Cy5.5(生產批號：551400)、Anti-Human CD95 PE-Cy7(生產批號：555674)、Anti-Human PD-1 APC(生產批號：558694)均購自美國BD公司，4%多聚甲醛購自BioSharp公司(生產批號：BL539A)。

1.3 檢測方法 于清晨抽取納入對象空腹狀態下的外周靜脈血10 mL，存放于EDTA管中，再用淋巴細胞分離液常規分離獲得外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。采用流式細胞儀檢測CD19、CD38、PD-1、CD95的表達水平：每個樣本取50 μL PBMC懸液，加入1 μL的相對應熒光素標記的抗人單克隆抗體，即Anti-Human CD19 APC-Cy7、Anti-Human CD38-PerCP-Cy5.5、Anti-Human CD95 PE-Cy7、Anti-Human PD-1 APC，在4℃條件下避光孵育30 min，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次并棄去上清后，再用500 μL的1%多聚甲醛固定重懸，最后用流式細胞儀上機檢測。本研究以CD19+B淋巴細胞作為細胞群，以熒光扣除對照作為設門依據，分析CD19+B淋巴細胞群上CD38、PD-1、CD95的表達水平。

1.4 設門策略 通過調整前向角散光(forward scatter,FSC)和側向角散射光(side scatter，SSC)選取PBMC，從選定的細胞群中根據所標記熒光設門CD19+B淋巴細胞，再從CD19+B淋巴細胞中設門觀察CD38、CD95、PD-1的表達情況，見圖1。

圖1 人PBMC設門策略

1.5 統計學分析 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；不符合正態分布的計量資料以[M(P25,P75)]表示，比較采用非參數秩和檢驗。繪制散點圖并采用相關分析法分析CD19+B淋巴細胞水平以及CD95、CD38、PD-1表達量之間的關系。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組CD19+B淋巴細胞水平的比較 未治療組、治療組、健康對照組CD19+B淋巴細胞水平依次升高(均P<0.05)，見表1和圖2。

表1 3組CD19+B淋巴細胞水平的比較[M(P25，P75)，%]

圖2 各組CD19+B淋巴細胞水平檢測結果

2.2 3組CD19+B淋巴細胞CD38表達水平的比較 健康對照組和治療組CD19+B淋巴細胞CD38的表達水平均低于未治療組(均P<0.05)，而治療組和健康對照組CD19+B淋巴細胞CD38的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表2和圖3。

表2 3組CD19+B淋巴細胞CD38表達水平的比較[M(P25，P75)，%]

圖3 各組CD19+B淋巴細胞CD95的表達情況

2.3 3組CD19+B淋巴細胞CD95表達水平的比較 未治療組、治療組、健康對照組CD19+B淋巴細胞CD95的表達水平依次降低(均P<0.05)。見表3和圖4。

表3 3組CD19+B淋巴細胞CD95表達水平的比較(x±s，%)

圖4 各組CD19+B淋巴細胞CD95的表達情況

2.4 3組CD19+B淋巴細胞PD-1表達水平的比較 未治療組和治療組CD19+B淋巴細胞PD-1的表達水平均高于健康對照組(均P<0.05)，而治療組與未治療組CD19+B淋巴細胞PD-1的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表4和圖5。

表4 3組CD19+B淋巴細胞PD-1表達水平的比較[M(P25，P75)，%]

圖5 各組CD19+B淋巴細胞PD-1的表達情況

2.5 未治療組CD19+B淋巴細胞水平、CD95、CD38、PD-1表達水平之間的相關性 相關分析結果顯示，未治療組HIV-1感染者外周血CD19+B淋巴細胞水平與CD38的表達水平、CD95的表達水平、PD-1的表達水平均不相關(均P>0.05)；CD38的表達水平與CD95的表達呈正相關(P<0.05)，而與PD-1的表達水平不相關(P>0.05)；CD95的表達水平與PD-1的表達水平間也無相關性(P>0.05)。見圖6。

圖6 未治療組中CD19+B淋巴細胞水平以及CD38、CD95、PD-1表達水平之間的相關性

2.6 治療組外周血CD19+B淋巴細胞水平、CD95、CD38、PD-1 表達水平的相關性 相關性分析結果顯示，治療組HIV-1患者外周血CD19+B淋巴細胞水平以及CD38、CD95、PD-1的表達水平，兩兩之間均不相關(均P>0.05)。見圖7。

圖7 治療組中CD19+B淋巴細胞水平以及CD38、CD95、PD-1表達水平之間的相關性

3 討 論

HIV-1感染會導致機體淋巴細胞異常，如CD4+T淋巴細胞、單核巨噬細胞、CD8+T淋巴細胞和B淋巴細胞等。CD4+T淋巴細胞數量隨著感染的進展持續性減少，常作為HIV感染的臨床分期依據[6-7]。本研究中未治療組、治療組、健康對照組CD19+B淋巴細胞的百分比依次升高(均P<0.05)。這提示ART可能影響HIV-1感染者外周血中CD19+B淋巴細胞的表達。隨著HIV-1感染的進展，CD19+B淋巴細胞的表達可能是動態變化的，細胞的活化與耗竭可能是并存的。為進一步探究CD19+B淋巴細胞活化與耗竭的變化規律，我們選取CD38、CD95、PD-1這幾個指標進行進一步研究。

CD38存在于B淋巴細胞表面，與B淋巴細胞的活化相關，CD38與B淋巴細胞受體以及CD19/CD21/CD81共受體等組成共刺激復合物，在復合物的刺激下B淋巴細胞的活化閾值降低，此外，CD38可激活磷脂酰肌醇激酶途徑，促進B淋巴細胞的發育[8-9]。HIV-1感染可導致CD38表達升高，CD38的表達與體內HIV-1的載量呈正相關，因此CD38可間接反映體內的HIV-1載量[10]。本研究結果顯示，未治療組的CD19+B淋巴細胞的CD38表達水平高于治療組和健康對照組(均P<0.05)，提示，在HIV-1感染進程中CD19+B淋巴細胞水平降低，導致CD19+B淋巴細胞的活化閾值降低，CD38隨之表達并促進CD19+B淋巴細胞的成熟、修復。而治療組與健康對照組CD19+B淋巴細胞的CD38表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，提示ART可能作用于CD38，活化CD19+B淋巴細胞，從而彌補HIV-1感染造成的B淋巴細胞受損。

CD95主要存在于活化的T淋巴細胞和B淋巴細胞表面，可通過依賴胱天蛋白酶通路介導細胞凋亡[11]。研究顯示，未經治療的HIV-1感染者的B淋巴細胞中CD95的表達增加，這可能導致細胞的加速更新以及細胞對病原體、疫苗抗原的記憶喪失[12-14]。本研究中，未治療組、治療組、健康對照組CD19+B淋巴細胞CD95的表達水平依次降低(P<0.05)，即經ART后HIV感染者的CD95表達水平雖較未治療組低，但仍高于健康對照組，不能完全恢復到健康人的狀態。這提示ART部分作用于CD95，而CD95能介導凋亡，誘導CD19+B淋巴細胞凋亡，間接抑制了體液免疫[15]。

PD-1參與HIV-1的感染進程，在T淋巴細胞、B淋巴細胞和單核細胞等細胞中均有表達，它能通過抑制機體的免疫功能，促進疾病發展[16-19]。相關研究表明，HIV-1患者外周血中可溶性PD-1含量高于健康對照組，且與病毒載量呈正相關，與CD4淋巴細胞計數呈負相關[20]；在HIV-1感染進程中，CD8+T淋巴細胞中PD-1表達水平影響CD8+T淋巴細胞的活化及功能[21]。在本研究中，治療組、未治療組CD19+B淋巴細胞的PD-1表達水平均高于健康對照組(均P<0.05)，但治療組與未治療組之間差異無統計學意義(P>0.05)，這提示ART可能不作用于PD-1。

我們為進一步分析CD19+B淋巴細胞耗竭與活化之間的相關性。結果顯示，治療組外周血CD19+B淋巴細胞水平及CD19+B淋巴細胞上的CD38、PD-1、CD95的表達水平之間均不相關(均P>0.05)；在未治療組中僅有CD38與CD95的表達水平之間呈正相關(P<0.05)，而其他指標之間均不存在相關性(均P>0.05)。這提示在HIV-1感染者中CD19+B淋巴細胞的活化與耗竭間存在正相關關系，且ART可能影響CD38與CD95之間的互作用。

綜上所述，ART可能通過影響HIV-1感染者CD19+B淋巴細胞中CD38與CD95的表達及二者之間的相互作用，對HIV-1感染者的體液免疫功能發揮一定的修復作用。ART可能不影響HIV-1感染者CD19+B淋巴細胞中PD-1的表達水平。ART增強CD19+B淋巴細胞活化并抑制其凋亡的作用，或可成為今后抗HIV-1感染的一個新思路。