慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者血清自噬相關(guān)蛋白水平及其臨床意義探討*

黃霜湘，姚朝光，藍 婧，歐 琴，覃冬林，陳麗芬，黃潔婕

肝衰竭可由病毒感染、酒精性、藥物性肝病和其他等原因引起，導(dǎo)致嚴重的肝臟合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化功能障礙，臨床主要表現(xiàn)為凝血功能障礙、黃疸、腹水等，肝組織病理學(xué)特征為大塊肝壞死，臨床病死率可高達60%以上[1-3]。慢加急性肝衰竭(acute on chronic liver failure，ACLF)是指在慢性肝病的基礎(chǔ)上出現(xiàn)新的肝細胞壞死性病變引起的肝衰竭，我國以乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的ACLF(HBV-ACLF)最為普遍[4-6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，HBV-ACLF臨床尚無特效治療藥物、病死率高，對患者預(yù)后進行準確的判斷，并適時開展人工肝支持系統(tǒng)或血液凈化治療，對合理利用醫(yī)療資源，改善患者預(yù)后意義重大。有關(guān)血清學(xué)指標預(yù)測肝衰竭患者臨床轉(zhuǎn)歸的研究報道較多，比如應(yīng)用血清凝血酶原活動度、國際標準化比值(international standard ratio，INR)、血清膽堿酯酶和C反應(yīng)蛋白等一系列肝功能指標或細胞因子以判斷肝損害或肝衰竭患者的預(yù)后[7，8]。然而，由于發(fā)病機理的復(fù)雜性，這些指標對患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸的判斷價值都存在局限性，因此需要更多研究來發(fā)現(xiàn)更多的相關(guān)因子。自噬是過量物質(zhì)或損壞或老化的細胞器被分解的過程，在ACLF等肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。p62、Beclin1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)為自噬相關(guān)蛋白，但較少用于HBV-ACLF患者預(yù)后的評估[9，10]。本研究探討了應(yīng)用血清自噬相關(guān)蛋白對HBV-ACLF患者預(yù)后的預(yù)測價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2018年9月～2020年9月我院收治的HBV-ACLF患者60例，男36例，女24例；年齡31～58歲，平均年齡為(43.7±4.7)歲。ACLF診斷符合《肝衰竭診治指南(2018年版)》的診斷標準[11]，有乙型肝炎病史。排除標準：有飲酒習慣(女性大于20 g/d，男性大于40 g/d)，酒精性肝炎或其他病因?qū)е碌腁CLF、合并甲狀腺功能改變性疾病、合并惡性腫瘤、近2個月內(nèi)應(yīng)用過免疫抑制劑者。另選擇同期健康人65例作為對照，男35例，女30例；年齡30～62歲，平均年齡為(44.9±5.4)歲。兩組性別和年齡比較無顯著性差異(P>0.05)。納入的所有HBV-ACLF患者簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核。

1.2 血清指標檢測 采集靜脈血3 mL，3000 r/m離心10 min，分離血清。采用ELISA法檢測血清p62、LC3-Ⅱ和Beclin1水平(優(yōu)尼康公司試劑，美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的680型全自動酶標儀)；使用日本佳能TBA-FX8型全自動生化分析儀及其配套試劑盒檢測血生化指標；采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法測定血清HBV DNA(試劑盒購自貝克曼庫爾特有限公司)。終末期肝病模型評分(model for end-stage liver disease，MELD)=3.78×ln[TBIL(mg/dl)]+11.2×ln[INR]+9.57×ln[sCr(mg/dl)]+6.43。

1.3 治療方法 所有HBV-ACLF患者均接受內(nèi)科綜合治療，包括抗病毒、護肝、退黃、促肝細胞再生、調(diào)節(jié)免疫功能等，并根據(jù)病情間斷給予血漿置換或血液濾過支持治療，必要時進行血漿置換聯(lián)合血液濾過或雙重血漿分子吸附系統(tǒng)聯(lián)合血液濾過治療。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清HBV DNA和肝功能指標比較 60例HBV-ACLF患者血清TBIL、ALB和INR水平顯著異常(表1)。

表1 兩組血清HBV DNA和肝功能指標比較

2.2 兩組血清自噬相關(guān)蛋白水平比較 HBV-ACLF患者血清LC3-Ⅱ和Beclin1水平顯著高于健康人，而血清p62水平顯著低于健康人(P<0.05，表2)。

表2 兩組血清自噬相關(guān)蛋白水平比較

2.3 不同疾病轉(zhuǎn)歸的HBV-ACLF患者血清自噬相關(guān)蛋白水平和MELD評分比較 本組患者在治療觀察的90 d，死亡18例(30.0%)；入院時，死亡的HBV-ACLF患者血清LC3-Ⅱ、Beclin1水平和MELD評分均顯著高于生存組，而血清p62水平顯著低于生存組(P<0.05，表3)。

表3 不同轉(zhuǎn)歸的HBV-ACLF患者血清自噬相關(guān)蛋白和MELD評分比較

2.4 MELD和血清自噬相關(guān)蛋白聯(lián)合預(yù)測HBV-ACLF患者預(yù)后的效能分析 以MELD評分>18.3 分為截斷點預(yù)測HBV-ACLF患者不良預(yù)后的曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.917，約登指數(shù)為0.758，其敏感度為93.7%，特異性為82.1%；以血清p62<2.2 ng/mL為截斷點，預(yù)測HBV-ACLF患者不良預(yù)后的AUC為0.856，約登指數(shù)為0.485，其敏感度為85.2%，特異性為63.3%；以血清LC3-Ⅱ>70.3 ng/mL為截斷點預(yù)測HBV-ACLF患者不良預(yù)后的AUC為0.820，約登指數(shù)為0.588，其敏感度為80.0%，特異性為78.8%；以血清Beclin1>12.6 ng/mL為截斷點預(yù)測HBV-ACLF患者不良預(yù)后的AUC為0.765，約登指數(shù)為0.399，其敏感度為79.6%，特異性為60.3%；應(yīng)用三者聯(lián)合預(yù)測HBV-ACLF患者死亡的AUC為0.910，其敏感度為95.2%，特異性為80.0%，預(yù)測價值顯著優(yōu)于任何一個單因素預(yù)測(Z=2.998、Z=3.025、Z=3.548，P<0.05，圖1)。

圖1 MELD評分和血清自噬相關(guān)蛋白聯(lián)合預(yù)測HBV-ACLF患者預(yù)后的ROC曲線分析

3 討論

肝臟疾病的最終預(yù)后取決于多種因素，但目前針對失代償期肝硬化和肝衰竭患者的治療還存在諸多問題[12，13]。因此，如何有效控制肝病的發(fā)展、準確評估療效、預(yù)測預(yù)后，對于肝衰竭患者選擇合適的治療方法和時機非常重要。目前，自噬在疾病發(fā)病過程中的作用是研究的熱點之一。自噬在細胞的生長發(fā)育和生物學(xué)功能發(fā)揮方面起著維穩(wěn)的功能。然而，當細胞的損傷超過了細胞自身的修復(fù)能力時，將啟動吞噬死亡[14]。為了進一步探討自噬在HBV-ACLF發(fā)病過程中的作用，為臨床干預(yù)治療提供依據(jù)，本研究對比分析了不同預(yù)后的HBV-ACLF患者血清自噬相關(guān)蛋白水平的變化差異。

LC3是一個位于自噬雙膜上的自噬相關(guān)蛋白，編碼LC3的基因與Atg8是同源的，主要參與自噬的延展，在細胞內(nèi)以LC3-I和LC3-Ⅱ的形式存在。在機體自噬激活時，LC3-I通過泛素化修飾，與磷脂酰乙醇胺聚合而延長雙層膜，最終形成LC3-Ⅱ型。LC3-Ⅱ可被用于標志自噬水平；Beclin 1是在自噬過程中在哺乳動物體內(nèi)最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑癌基因之一，通過與多種輔因子相結(jié)合調(diào)節(jié)Vps-34活性，形成Beclinl-Vps34-Vpsl5復(fù)合體，誘導(dǎo)自噬的啟動[15，16]。本研究中，HBV-ACLF患者血清LC3-Ⅱ和Beclin 1顯著高于健康人，說明HBV-ACLF患者體內(nèi)自噬水平出現(xiàn)異常，究其原因可能是細胞內(nèi)環(huán)境在慢性炎癥疾病的影響下發(fā)生改變，而HBV DNA載量增多也會提升細胞自噬水平，這一結(jié)論在一些研究[17]中也得到了證實；p62蛋白作為自噬降解底物，一般與LC3-Ⅱ和泛素化蛋白質(zhì)聚合，其C端和N端分別結(jié)合泛素化蛋白LC3-Ⅱ，集成到自噬吞噬體中，然后在自噬溶酶體降解，其水平與自噬功能成反比[18，19]。本研究中，HBV-ACLF患者血清p62顯著低于健康人，與HBV-ACLF患者肝功能下降和肝組織改變導(dǎo)致自噬激活有關(guān)。所以，HBV-ACLF患者細胞自噬水平增強。本研究發(fā)現(xiàn)死亡組HBV-ACLF患者入院時MELD評分顯著高于生存組，MELD評分系統(tǒng)在終末期肝病患者的預(yù)后評估中優(yōu)勢明顯[20，21]。值得關(guān)注的是，死亡的HBV-ACLF患者血清LC3-Ⅱ水平顯著高于生存組，血清p62水平顯著低于生存組，提示自噬相關(guān)蛋白與HBV-ACLF患者預(yù)后有一定的關(guān)聯(lián)。HBV-ACLF患者自噬被激活，隨著肝功能的減退，自噬相關(guān)蛋白水平發(fā)生了顯著的改變。自噬相關(guān)蛋白誘導(dǎo)細胞對于損傷細胞器和蛋白的降解能力顯著提升，與疾病的預(yù)后關(guān)系密切。

本研究應(yīng)用ROC曲線評估三種自噬蛋白對患者預(yù)后的預(yù)測價值，發(fā)現(xiàn)以血清p62<2.2 ng/mL為截斷點預(yù)測HBV-ACLF預(yù)后不良的AUC為0.856；分別以LC3-Ⅱ>70.3 ng/mL和Beclin1>12.6 ng/mL為截斷點預(yù)測HBV-ACLF預(yù)后不良的AUC為0.820和0.765，三者聯(lián)合預(yù)測HBV-ACLF預(yù)后不良的AUC為0.910，顯著優(yōu)于三者單獨預(yù)測，與MELD評分的預(yù)測價值相近，提示三者聯(lián)合對HBV-ACLF患者預(yù)后的預(yù)測價值較高。今后在臨床治療中，可以對HBV-ACLF患者自噬相關(guān)蛋白水平進行動態(tài)檢測和分析，進一步研究其變化規(guī)律和影響因素，有望成為預(yù)測HBV-ACLF患者預(yù)后的新的標志物。但本研究病例來自同一醫(yī)院、隨訪時間較短，研究結(jié)果可能存在一定的偏差，有待擴大樣本量進行多中心和前瞻性的研究，進一步探究HBV-ACLF患者血清p62、Beclin1和LC3-Ⅱ水平檢測的臨床意義。

綜上所述，本研究60例HBV-ACLF患者血清自噬相關(guān)蛋白水平顯著不同于正常人，應(yīng)用三者聯(lián)合可為HBV-ACLF患者的預(yù)后評估提供更為準確的預(yù)測方法。