非酒精性脂肪性肝病動物模型研究進展*

張譯之，張曉慧 綜述，陳 煜 審校

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease ，NAFLD)是指與過量飲酒無關的，以肝細胞脂肪變性和脂質貯積為特征的臨床病理綜合征[1]。NAFLD疾病譜包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化、NAFLD相關性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，疾病過程通常伴隨脂肪增加、體質量增加、胰島素抵抗、血脂異常，組織學可見肝脂肪變性、小葉炎癥、肝細胞氣球樣變、細胞周圍纖維化等。全球NAFLD的患病率逐年增高。目前，亞洲患病率為27%[2]，尚缺乏用于NAFLD的有效藥物，也缺乏精準的方法識別NAFLD和NASH危險人群，還缺乏模擬疾病和測試新藥的最佳體外模型，因此構建合適的肝脂肪變性實驗模型具有重要的意義。

1 動物模型

NAFLD動物模型可分類為遺傳模型、營養模型、遺傳和營養因子的組合模型[3]。

1.1 基因敲除或基因突變模型 1) ob/ob 小鼠和 db/db 小鼠模型。db/db小鼠是常染色體隱性糖尿病基因(db)的純合子。該基因編碼瘦素受體(Ob-Rb)的點突變，導致瘦素信號缺陷。db/db小鼠的瘦素水平無異常，但卻伴有瘦素抵抗。這些小鼠攝食量多，伴嚴重的肥胖、糖尿病和高胰島素血癥，肝臟病理表現為肝脂肪變性(大泡性)[4]。與db/db小鼠不同，ob/ob小鼠的瘦素編碼基因(ob基因)突變，表現為瘦素合成障礙。這些小鼠同樣存在超重、高攝食狀態、高胰島素血癥、高糖血癥和胰島素抵抗，病理也存在自發性肝脂肪變性。早在1997年[5]，人們就發現ob/ob小鼠在正常對照飲食中不會自發產生炎癥，如果給ob/ob小鼠第二次“打擊”，如注射細菌脂多糖，可誘發脂肪性肝炎。同樣地，給db/db小鼠缺乏蛋氨酸和膽堿(MCD)飲食干預或攝入反式脂肪，可以在NAFLD的基礎上誘發NASH。不同的是，ob/ob小鼠有抵抗肝纖維化的能力，因為在肝纖維化過程中需要瘦素的參與[6]；2)PTEN基因敲除小鼠。人類第10號染色體缺失的編碼與磷酸酶和張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10, PTEN)是一種重要的抑癌基因，它影響PI3K/Akt/mTOR途徑和胰島素信號途徑，是肝臟脂肪生成、葡萄糖代謝和腫瘤發生的重要介質[7，8]。肝特異性PTEN基因敲除的小鼠發展為NAFLD，對胰島素高敏感[9]。肝臟組織形態學不只可見大脂滴性脂肪肝、肝細胞腫脹、小葉內炎性細胞漫潤等酷似人NASH的病理組織學改變，而且完全可以重現“脂肪肝-脂肪性肝炎-肝纖維化-肝癌”的自然經過。研究表明66%肝細胞特異性PTEN基因敲除小鼠在74～78周齡時可發展為自發性肝癌[10]。因此，該模型常用來探索NASH以及相關HCC進展的機制；3)SREBP-1c轉基因小鼠。膽固醇調節元件結合蛋白-1c(sterol response element -binding protein 1c，SREBP-1c)是一種轉錄因子，影響脂質代謝。SREBP-1c轉基因小鼠表現為肝脂肪變性、胰島素抵抗，小葉炎癥、肝細胞氣球樣變和細胞周圍纖維化[11]。然而，該模型白色脂肪組織質量減少，循環瘦素水平低，因此其應用受到了與ob/ob小鼠相似的限制。此外，該小鼠在正常飲食20周后，會出現靜脈及細胞周圍纖維化，但整個疾病過程中沒有肥胖的發生[11]。

1.2 營養、藥物誘發模型 1)高脂飲食模型。高脂飲食(high-fat diet，HFD)模型所構建的NAFLD模型可以較好地反映人類NAFLD肝臟組織病理學。經典的HFD飲食能量來源組成為脂肪占比71%、碳水化合物11%、蛋白質18%。給予雄性C57BL/6[12]小鼠HFD喂養16周，結果HFD小鼠出現肝脂肪變性、TG水平升高、肝細胞氣球變，并出現胰島素抵抗。SD大鼠對高脂飲食更敏感，且雄性大鼠更易發生肝細胞脂肪變。Solinas et al[3]用雄性SD大鼠HFD飲食1～4周，與人脂肪肝的肝臟組織進行形態學比較，結果發現HFD動物模型與人類脂肪肝的相應階段有著密切的相似性。2016年，Asgharpourde et al[13]給予HFD動物不限制葡萄糖和果糖，可依次發展為NAFLD、NASH、進行性纖維化和HCC。然而，NASH的形成需要16周，晚期纖維化的形成需要36周。此外，肝癌的發生頻率遠高于人類；2)高膽固醇飲食(high cholesterol diet，HCD)模型。飲食中的膽固醇是動物模型[14]NAFLD進展為NASH的關鍵因素。單用HCD喂養的小鼠胰島素水平升高，但肝質量、甘油三酯水平和血清丙氨酸氨基轉移酶水平僅輕微升高[15]。然而，當高膽固醇與高脂肪結合時，有更明顯的NASH表現：小鼠體質量增加、肝臟脂質積聚增加、血清ALT水平升高、脂聯素水平降低、炎癥增加和纖維化，并且這些特征比在HFD或HCD小鼠中更為明顯。同樣地，高膽固醇、高膽酸鹽飲食小鼠也表現出脂肪變性、炎癥、肝細胞氣球樣變和纖維化[16, 17]。有研究表明，膳食膽固醇降低脂肪酸的VLDL合成和β-氧化，增加細胞凋亡和肝臟氧化應激[18]；3)高果糖飲食模型。 人類從富含果糖的食物中攝入大量熱量，影響了肥胖和NASH的發展[19]。C57BL/6小鼠喂食HFD或高脂高果糖(high-fat high-fructose，HFHF)飲食，結果發現兩組小鼠的體質量增加、體脂含量、胰島素抵抗和肝脂肪變性相似，HFHF小鼠肝臟巨噬細胞數量、轉化生長因子水平、肝氧化應激水平和膠原沉積增加[19]。在最近的一項研究中，給予Cxcr3基因敲除和C57BL/6野生型小鼠類似的HFHF飲食，Cxcr3基因敲除小鼠的肝臟組織學得到改善，壞死性炎癥水平降低，脂質過氧化減少，表明Cxcr3在HFHF小鼠模型NASH形成中起著關鍵作用[20]；4)蛋氨酸-膽堿缺乏飲食(methionine choline deficiency ，MCD)模型。食物中缺乏蛋氨酸及膽堿酸會影響到肝臟的β氧化和極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein ，VLDL)的轉運，導致肝內脂質積聚。在一項研究中[21]，實驗人員給予不同品系的大鼠MCD 飲食喂養4周，結果發現Wistar雄性大鼠脂肪變性最嚴重。雄性C57/BL6小鼠的炎癥和壞死最為嚴重，脂質過氧化和超微結構損傷，并最接近NASH的組織學特征。MCD模型的肝損傷發生迅速，但恢復正常飲食后是可逆的。然而，該模型的代謝特征與患者相反：胰島素、瘦素和葡萄糖水平降低。為解決上述問題，有學者聯合應用膽堿不足(CD)、HFD構建NAFLD相關動物模型，該飲食為20%蛋白質，35%碳水化合物和45%脂肪，不添加膽堿。實驗動物在6～12周發生NASH，12個月時，可誘導出NAFLD相關HCC[22]。

2 肝脂肪變性細胞模型

2.1 FFA誘導的細胞模型 人HepG2肝癌細胞株與肝細胞生物學功能相似，但能更好地耐受脂毒性，常用于研究肝細胞脂肪變。游離脂肪酸(free fatty acid ，FFA)可以合成TG，TG含量過高會引起肝脂肪變性。因此，FFA常用于誘導建立脂肪變性細胞模型。Zhang et al[23]采用25%胎牛血清和0.1%中/長鏈脂肪乳作用一段時間后，續貫用0.1 mmol/L FFA作誘導液繼續作用細胞，成功建立了脂肪變性模型。實驗室常用的細胞模型主要缺點是不能支持長時間培養、細胞易失去正常形態、脫離體內環境(如枯否細胞、肝星狀細胞等)的影響，并不能很好地反映肝細胞的表型和功能。Kozyra et al[24]用人原代肝細胞構建的3D球面細胞模型克服了這些缺點。該模型不僅維持了細胞形態,而且保存了肝細胞在病理狀態下的胰島素抵抗。

2.2 果糖誘導的細胞模型 研究發現，果糖水飼養C57BL/6小鼠8周即出現明顯的肝臟脂肪變，提示人類NAFLD的普及與甜味劑的大量使用及含糖飲料的攝入相關[25]。選擇人正常肝細胞系LO2細胞，以不同濃度的果糖處理24 h誘導細胞脂肪變性，并與FFA干預相比較，結果發現，4 mmol/L果糖作用于LO2細胞24 h后，即可上調肝細胞脂肪合成基因，從而導致肝細胞脂肪變。果糖誘導模型和經典的FFA誘導模型結果顯示，果糖可以顯著增加LO2細胞內脂質合成相關蛋白的表達，說明果糖可能主要影響脂質合成源頭，從而導致肝細胞內脂質沉積[26]。Kozyra用果糖作用3D模型時也岀現了脂肪變性，并呈時間依賴關系。當撤去脂肪變性培養液或加入治療性藥物后，脂肪變性緩解[24]。

2.3 基于細胞外基質支架構建3D肝臟NAFLD模型 肝細胞在2D環境中培養一段時間，其增殖能力和部分生物學功能喪失， 而在3D環境中培養時，肝細胞的增殖能力和生物學功能與2D環境相比大大提升[27]。因此，許多研究者探索應用生物材料構建細胞培養的三維微環境。Yamada et al[28]構建了一種由3T3細胞-肝細胞-3T3 細胞構成的三明治樣類肝索結構的凝膠纖維模型，該模型的肝細胞與傳統的平面培養相比，肝細胞特異性蛋白表達增多，白蛋白和尿素合成能力增強。Rennert et al[29]在此基礎上，嘗試將更多種類的細胞(如內皮細胞、外周血單核細胞、HepaRG 細胞、星狀細胞)植入“三明治”模型共培養，以期更接近正常的肝索結構。近年來，3D打印技術也應用于三維支架的構建，將誘導體系與細胞混合噴涂，疊加其他種類細胞、生長因子、信號分子等，在計算機指令下打印，形成有生理功能的活體器官。

蛋白質組學分析發現，肝臟微環境的細胞外基質蛋白種類繁多[30]，因此事實上肝臟來自細胞外基質的信號遠比2D細胞培養基質成分復雜得多。隨著細胞培養技術、肝臟組織工程技術的發展，出現了一些新的方法制備人工肝臟。肝臟組織工程的核心首先是通過肝臟脫細胞獲得理想的支架材料，支架保留了細胞外基質，去除了細胞、遺傳物質，降低了免疫原性。組織工程的另一核心是生物支架的再細胞化，灌注的細胞可為肝細胞、干細胞、內皮細胞等，這樣即可獲得具有功能的組織工程肝臟。Uygun et al[31]在2010年成功將肝細胞種植到脫細胞肝臟支架上，并檢測再細胞化后肝臟白蛋白的分泌、尿素合成等功能。Wu[32]將人肝細胞株HepG2種植到肝基質支架，灌流完全培養基，使細胞形成功能性肝組織。隨后,用高脂培養基灌注該組織，建立了與NAFLD肝臟相似的組織工程脂肪肝(tissue engineering fatty liver，TEF)模型。培養8天后發現TEF脂肪積累比對照組多2倍，脂肪酸代謝受損，與NAFLD相關的PDK4、CYP2E1、CYP7A1基因均上調，CYP3A4代謝活性明顯受損。TEF肝隨后用二甲雙胍處理，結果發現與NAFLD患者使用二甲雙胍有相似的效果。由此可見，TEF肝臟為研究NAFLD的發展過程和藥物效應提供了一個穩定和可重復的模型。但是,這一模型缺乏肝臟非實質細胞與肝細胞相互作用，細胞外基質中缺乏許多重要的影響因子。

3 小結

NAFLD理想的模型應有脂肪增多、體質量增加、胰島素抵抗、血脂異常并全譜表達NAFLD組織學，還應與纖維化進展有關。然而，在各種模型中，誘導脂肪變性相對容易，但完全轉化為人類NAFLD-NASH-肝纖維化-HCC的疾病過程仍然是一個挑戰。

2D體外脂肪變性細胞模型因其實驗周期短、重復性好、實驗條件易于控制。HFD模型可以反映人NAFLD的疾病演變過程,且造模停止后病變也不會很快好轉，為試驗中藥物干預提供窗口。但該模型造模時間較長，目前要解決時間成本問題，高脂飼料配方的尚有改良的余地。研究顯示飼料中脂肪含量越高，小鼠體質量和肝質量越高，肝臟脂肪變性程度越高[33]。對于遺傳學模型如瘦素及瘦素信號通路缺陷模型，這種突變在肥胖人群中并不普遍，與遺傳問題相關的脂肪變性病例也并不常見[34]。此外，由于代謝背景的不同，遺傳模型顯示出不同的肝細胞損傷[35]。目前，尚沒有一種模型能在完美復制人類疾病和時間成本上實現雙贏，但組織工程肝臟模型或許可以將這一目標變為可能：它在一定程度上結合了2D模型和傳統動物模型的優勢，目前我們需要克服的障礙是解決在單純性脂肪變性的基礎上脂質過氧化產物在肝細胞中積聚并伴隨炎性細胞浸潤和/或膠原沉積(如纖維化)而引起的細胞損傷。這種反應是NAFLD進展為肝纖維化、肝硬化的必由之路。因此，我們需要利用不同的實質細胞和非實質細胞的共培養來改善我們的模型，模擬NAFLD患者肝臟中實際存在的細胞-細胞、細胞-因子相互作用，從而創造更精確的組織三維模型。

通過不斷開創新的造模方法，使動物模型、細胞模型能更加符合人類NAFLD的疾病的特點，更加迎合研究者的意圖，提高模型的重復性及穩定性，為人類早日認識NAFLD的發生機制及獲得臨床干預提供可能。