HIF-1α對非酒精性脂肪性肝病小鼠肝組織的影響*

李 妍，陸倫根，蔡曉波

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是除外酒精和其它明確肝損因素所致的、以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變為主要特征的一組臨床病理綜合癥，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)以及進展而來的肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌(hepatocellular caicinoma，HCC)等一系列疾病譜[1-4]。腸道微生態失衡導致腸粘膜屏障功能減弱、通透性增加，腸源性細菌及細菌產物經門靜脈入肝，激活肝臟炎癥反應[5-8]。動物實驗證實長期高脂飲食影響肝臟線粒體能量代謝，導致缺氧應激[9]。缺氧是脂肪組織功能障礙的關鍵影響因素，可能導致脂肪纖維化和炎癥、IR、肝臟脂肪代謝異常等病理情況[10]。慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease ，COPD)患者往往長期處于缺氧狀態，因此COPD患者合并單純性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的發病率分別高達41.4%和36.9%，顯著高于未罹患COPD者[11]。此外，有研究顯示阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征引起的間歇性缺氧可導致氧化應激、線粒體功能障礙、炎癥和交感神經系統過度激活，是NAFLD發病和進展[12-14]的風險因素之一。上述發現提示我們，缺氧狀態是NAFLD發病的風險因素之一。缺氧誘導因子1 (hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)屬于堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子中的PER-ARNT-SIM(PAS)亞家族，是細胞和組織對缺氧應激反應的主要調節因子[15]。HIF-1的靶基因包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和促紅細胞生成素等。HIF-1通過與靶基因啟動子內的缺氧應答元件結合調節轉錄，增加組織供氧、減少氧耗，以便機體和組織適應缺氧狀態[16]。HIF-1是由缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)和缺氧誘導因子1β(hypoxia-inducible factor 1β，HIF-1β)兩個亞基組成的異源二聚體，其中HIF-1α亞基的穩定性受到細胞內氧濃度的調節，HIF-1β則不受氧濃度調節能夠恒定表達。在常氧條件下，HIF-1α在脯氨酰羥化酶作用下特定脯氨酸殘基位點發生羥基化反應。羥基化的HIF-1α能夠被von hippel-lindau(VHL)腫瘤抑制基因識別，作為泛素連接酶E3復合體的底物發生多聚泛素化，進而被蛋白酶復合體降解。在缺氧條件下，脯氨酰羥化酶活性受到抑制，HIF-1α轉位至細胞核內，與HIF-1β亞基聚合生成具有轉錄因子活性的HIF-1[17]。因此，HIF-1α是一種缺氧誘導的轉錄因子，是細胞和組織缺氧的標志。動物實驗證實,短期高脂飲食后，早在炎癥反應和IR尚未發生之前，即可出現白色脂肪缺氧和HIF-1α表達上調[18]。研究顯示兒童NAFLD患者往往伴有組織缺氧和HIF-1α表達上調[19]，提示缺氧是早期炎癥反應和脂肪組織功能紊亂的重要特征，HIF-1α在這一過程中可能有重要的調節作用。本研究通過飼喂高脂飲食和蛋氨酸-膽堿缺乏飲食(methione-choline deficient，MCD)飲食構建兩種不同的NAFLD小鼠模型，分別檢測其肝組織缺氧程度、HIF-1α mRNA和蛋白表達水平，并采用HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染小鼠肝星狀細胞JS-1細胞，檢測其細胞活性并提取細胞總RNA，行逆轉錄后采用Real-time PCR法檢測細胞1型膠原(COL1)和3型膠原(COL3)、TNF-α、IL-1β和TGF-β1等基因mRNA水平，以進一步探討HIF-1α對NAFLD發病的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞和試劑 雄性C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。JS-1細胞株購自雅吉生物有限公司。HIF-1α ShRNA腺病毒載體購自吉凱基因。基礎飼料和MCD飼料均購自美迪森生物有限公司。胎牛血清和DMEM培養基購自Gibco。麻醉藥物、甲醛固定液、HE染色液、TRIzol RNA抽提試劑、MTT試劑盒等購自碧云天生物技術有限公司，逆轉錄試劑盒、Real-time SYBR Green試劑購自大連Takara公司，所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。缺氧探針檢測試劑盒購自北京博蕾德科技發展有限公司。

1.2 NAFLD模型的制備 給予30只小鼠飼喂基礎飼料1 w后，隨機分為3組，每組10只，其中正常飲食對照組10只，飼喂基礎飼料；高脂飲食模型組10只，飼喂高脂飼料，自由攝食飲水，高脂飼料配比如下：基礎飼料88%、豬油10%、膽固醇2%；MCD模型組10只，飼喂MCD飼料，自由攝食飲水。在實驗第12 w末，將小鼠禁食12 h后測量體質量，給予氯胺酮0.2 g.kg-1腹腔注射麻醉，分離肝臟組織，切取0.5 cm× 0.5 cm× 0.5 cm大小肝組織經甲醛固定液固定，行石蠟包埋切片，將剩余的肝臟組織儲存于液氮中，用于RNA和蛋白抽提。根據NAFLD活動度積分(NAFLD activity score，NAS)標準計算肝組織NAS積分[20]，評估各組脂肪肝程度。NAS積分評分標準為0～8分：①肝細胞脂肪變：0分(<5%)，1分(5%～33%)，2分(34%～66%)，3分(>66%)；②小葉內炎癥(20倍鏡計數壞死灶)：0分為無壞死灶，1分(<2個)，2分(2～4個)，3分(>4個)；③肝細胞氣球樣變：0分為無，1分，少見，2分，多見。其中，對NAS<3分者，排除NASH診斷，NAS=3分或4分者為臨界NASH，NAS≥5分者為確診NASH。

1.3 肝組織缺氧程度的評估 在處死動物前6 h，經尾靜脈注射派諾硝唑探針溶液60 mg.kg-1，分離部分肝臟組織，經甲醛固定，行石蠟包埋切片，用于后續染色以評估缺氧程度。

1.4 HIF-1α低表達JS-1細胞株的構建 將細胞凍存管在37 ℃水浴中快速搖晃融化，加入5 ml含10%胎牛血清的DMEM培養基混勻，1000 r/m離心4 min，棄上清，加上述培養基2 ml，吹勻后將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基，置于培養箱(溫度37 ℃，濕度95%，CO25%)。待細胞融合度達90%時傳代，待細胞生長狀態良好時用于實驗。細胞實驗分為3組，即對照組、腺病毒載體組和HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染組。傳代接種密度為8×104個細胞/孔(6孔板)或2500個細胞/孔(96孔板)，接種后22～24 h換液，在實驗組分別同時加入腺病毒載體或HIF-1α ShRNA腺病毒載體：1×108/孔(6孔板)或3×106/孔(96孔板)。輕柔搖晃培養板。繼續培養24 h換液。接種于6孔板的細胞于傳代后48 h收集細胞，提取細胞總RNA和蛋白，分別采用Real-time PCR和Western blotting法檢測證實HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染組細胞HIF-1α mRNA和蛋白表達水平較對照組和腺病毒載體組明顯下降(P<0.05，圖1)。經Real-time PCR檢測各組細胞COL1、COL3、TNF-α、IL-1β和TGF-β1 mRNA水平。接種于96孔板的細胞于傳代后48 h更換含0.5%胎牛血清的DMEM培養基，繼續培養24 h，采用MTT試劑盒檢測各組細胞活性。

圖1 HIF-1α低表達JS-1細胞株的構建 a： HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染組JS-1細胞HIF-1α mRNA水平較對照組和腺病毒載體組顯著下降(P<0.05)；b和c：HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染組JS-1細胞HIF-1α 蛋白表達水平較對照組和腺病毒載體組顯著下降

2 結果

2.1 小鼠脂肪肝模型建立成功 在光鏡下，正常組小鼠肝組織結構完整，肝細胞形態規則；高脂飲食模型組和MCD模型組小鼠肝組織可見明顯的肝細胞脂肪變和肝細胞氣球樣變，間質可見炎性細胞浸潤(圖2)。在第12 w末，高脂飲食模型組NAS積分為6.170±0.302，顯著高于對照組(0.020±0.042，P<0.05)，MCD模型組NAS積分為5.940±0.241，也顯著高于對照組(P<0.05)，證實高脂飲食和MCD模型組小鼠肝組織符合NASH診斷。

圖2 小鼠肝組織病理學表現 (HE，200×) 高脂飲食模型組：小鼠肝組織可見大面積肝脂肪變性和肝細胞氣球樣變，間質可見炎性細胞浸潤，可見少量點狀壞死灶和Mallory小體；MCD模型組：小鼠肝組織可見中到重度肝脂肪變性，可見肝細胞氣球樣變，間質可見炎性細胞浸潤，壞死灶和Mallory小體罕見

2.2 小鼠肝組織缺氧情況 見圖3。

圖3 小鼠肝組織缺氧探針染色表現(派諾硝唑探針，200×) 缺氧探針試劑盒染色顯示高脂飲食模型組和MCD模型組小鼠肝組織染色陽性率分別為85%和78%，顯著高于對照組的7%(P<0.05)

2.3 三組肝組織HIF-1αmRNA及其蛋白表達比較 見圖4。

圖4 三組肝組織HIF-1αmRNA及其蛋白表達比較 左圖：高脂飲食模型組和MCD模型組小鼠肝臟HIF-1α mRNA水平分別為對照組小鼠的2.1倍和1.6倍(P<0.05)；右圖：高脂飲食組和MCD組小鼠肝臟HIF-1α蛋白表達水平明顯增強

2.4 HIF-1α ShRNA抑制小鼠肝星狀細胞HIF-1α表達后細胞活力情況 見圖5。

圖5 三組活力變化 HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染組細胞活力較對照組或空載體組明顯下降，僅為對照組的37%(P<0.05)

2.5 三組細胞相關細胞因子mRNA水平比較 見圖6。

圖6 三組細胞相關因子mRNA水平變化 a： HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染組細胞COL1和COL3 mRNA水平較對照組或腺病毒載體組明顯下降(P<0.05)；b：HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染組細胞TNF-α、IL-1β、TGF-β1 mRNA較對照組或腺病毒載體組均明顯下降(P<0.05)

3 討論

NAFLD的發病機制極其復雜。缺氧是脂肪組織功能障礙的關鍵影響因素。大量研究證實缺氧狀態是早期炎癥反應和脂肪組織功能紊亂的重要特征，也是NAFLD發病的風險因素之一。HIF-1α受缺氧的誘導，是細胞和組織缺氧的標志。本研究分別通過飼喂高脂飲食和MCD飲食構建兩種不同的NAFLD小鼠模型，檢測肝組織缺氧程度、HIF-1α mRNA和蛋白表達水平或采用HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染小鼠肝星狀細胞JS-1細胞，檢測細胞活性并檢測COL1、COL3、TNF-α、IL-1β、TGF-β1等基因mRNA水平，以進一步探討HIF-1α對NAFLD發病的影響。結果顯示，高脂飲食模型組和MCD模型組小鼠肝組織明顯缺氧，且HIF-1α mRNA和蛋白表達水平均明顯增強，提示缺氧在NAFLD發生和進展過程中有重要作用，HIF-1α可能參與調節這一過程。我們進一步采用HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染JS-1細胞株，發現其細胞活力明顯下降，COL1、COL3、TNF-α、IL-1β、TGF-β1 等相關基因mRNA水平也明顯下降，提示抑制HIF-1α表達能夠抑制肝星狀細胞活化、膠原合成和炎性細胞介質的分泌，意味著抑制HIF-1α表達可能延緩NAFLD進展，為NAFLD治療提供新的靶點和研究方向。