代謝相關性脂肪性肝病小鼠不同高脂飲食時期血糖水平和腸道菌群變化動態分析*

首第文，周永健，徐豪明，唐文娟，駱慶玲，梅 情，寧 鋼，趙 沖，黃紅麗，曹創裕，陳慧婷

代謝相關性脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease，MAFLD)是代謝綜合征的一部分，與2型糖尿病、胰島素抵抗和肥胖有關，已經成為一個世界性的健康問題[1, 2]。MAFLD的發病機制仍未完全確定，其中糖代謝紊亂[3]和腸道菌群調節失衡[4]是關鍵性因素。MAFLD患者存在腸道菌群紊亂，后者也影響胰島素抵抗和脂質代謝[5]。本研究旨在通過建立高脂飲食誘導的MAFLD小鼠動物模型，分析不同時期其胰島素耐受情況和血糖水平變化，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、飼料、試劑和儀器 雄性SPF級C57BL/ 6 小鼠12只，8周齡，體質量(22±1)g，購于廣東省醫學實驗動物中心，飼養在華南理工大學附屬第二醫院中心實驗室動物中心，每日交替進行12 h光照和12 h黑暗，室內相對濕度在(50±5)%，溫度在(23±1)℃。基礎飼料購于廣東省醫學實驗動物中心，60%高脂飼料購于戴茨公司(美國)，高脂飼料配方主要為：蛋白20% kcal，碳水化合物20% kcal，脂肪60% kcal。本實驗遵循實驗動物的3R原則，在華南理工大學附屬第二醫院動物醫學倫理委員會監管下完成。血糖儀和血糖檢測試紙(羅氏公司，中國)，注射用10%葡萄糖溶液(廣東大冢制藥有限公司)，重組人胰島素注射液(通化東寶藥業股份有限公司)。DNA提取試劑盒(D3141，廣州美基生物科技有限公司)，Nanorop 微量分光光度計(NanoDrop 2000，賽默飛世爾科技，美國)，PCR 相關試劑(TOYOBO，日本)， 瓊脂糖凝膠電泳儀(DYY-6C 型，北京六一儀器廠)，凝膠成像系統(Tanon-2500，上海天能科技有限公司)。PCR 儀(ETC811，東勝興業科學儀器有限公司)， Qubit 3.0(ThermoFischer Scientific，美國)。

1.2 MAFLD模型的制備 給予60% kcal脂肪飲食[6]，分別在高脂飲食0 w、8 w、16 w和24 w時測量體質量，并將小鼠置于代謝籠，收集糞便，將樣本立刻放入-80℃冰箱保存，統一行16 sRNA檢測；禁食不禁飲16 h，行葡萄糖耐量實驗(glucose tolerance test，GTT)，經尾靜脈取血，檢測空腹血糖[7]；禁食不禁飲4 h，行胰島素耐受實驗(insulin tolerance test，ITT)，即給予小鼠人短效胰島素0.5 U.kg-1腹腔注射，分別在15 min、30 min、45 min、60 min、90 min和120 min取血，檢測血糖濃度，繪制血糖變化曲線，計算曲線下面積(AUC)[7]。

1.3糞便腸道菌群檢測 采用D3141試劑盒提取糞便DNA。經瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 微量分光光度計檢測核酸，判斷DNA純度和濃度。擴增16s rDNA的V3-V4目標區域，引物序列如下：上游：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG，下游：3’-GGACTACHVGGGTATCTAAT。擴增片段長度為466 bp。使用ETC811分析儀進行cDNA擴增反應。使用 ABI Step One Plus Real Time PCR System(Life Technologies，美國) 進行定量。采用 Novaseq 6000的 PE250 模式 pooling 上機測序，廣州基迪奧生物科技有限公司提供專業的測序平臺和技術支持。α多樣性反映特定生態系統內物種多樣性情況，通常利用物種豐富度和均勻度兩個重要參數來計算。應用Chao 1指數和ACE指數估計樣本中運算的分類單位(operational taxonomic unit， OUT)數目，即物種的數目，Chao1指數和ACE指數的數值越大，代表樣本中所含物種越多[8]。

2 結果

2.1 四個時期小鼠葡萄糖耐量試驗比較 隨著高脂喂養時間延長，注射葡萄糖后小鼠血糖水平顯著升高(圖1)。

2.2 四個時期小鼠胰島素耐量試驗比較 隨著高脂喂養時間延長，注射胰島素后各時間小鼠血糖水平升高(圖2)。

圖2 不同時期小鼠ITT變化

2.3 不同時期小鼠糞便腸道菌群α多樣性比較 隨著高脂飲食喂養時間的延長，小鼠ACE指數和chao 1指數大幅升高(P<0.05，表1)。

表1 不同時期MAFLD小鼠腸道菌群α多樣性指數比較

2.4 四個時期小鼠糞便腸道菌群變化 在門水平，與0周比，喂養8周、16周和24周時小鼠菌群厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)比率顯著升高，而擬桿菌門(Bacteroidetes)和疣微菌門(Verrucomicrobia)比率顯著下降，差異均有統計學意義(P<0.05)；在屬水平，與0周比，喂養8周小鼠菌群艾克曼菌(Akkermansia)和瘤胃球菌科-UCG-014屬(Ruminococcaceae_UCG-014)比率顯著降低，喂養16周小鼠菌群艾克曼菌和瘤胃球菌科-UCG-014屬比率顯著降低，而紅蝽桿菌-UCG_002屬(Coriobacteriaceae-UCG-002)比率顯著升高(P<0.05)，喂養24周小鼠菌群艾克曼菌和瘤胃球菌科-UCG-014屬比率顯著降低，而紅蝽桿菌科-UCG_002屬和杜氏桿菌比率顯著升高(P<0.05，圖3)。

圖3 不同時期小鼠屬水平腸道菌群差異比較(橫坐標為時間(周)，縱坐標為細菌含量百分比)

3 討論

近年來，MAFLD發病率在全世界范圍內逐年升高，已成為最常見的慢性肝病和與肝臟相關死亡的重要原因。腸道菌群失衡和糖代謝紊亂在MAFLD發生發展過程中發揮著關鍵作用。采用高脂飲食建立的MALFD小鼠模型可形成肥胖和胰島素抵抗等表現[9]，與人類MAFLD發病機制和表現相似。MAFLD的發生發展及其嚴重程度與編碼炎性細菌產物的基因的豐富度有關。腸道微生物群的改變可能參與了MAFLD的發病，并可以作為疾病或嚴重程度的標志[10]。在動物模型，已有腸道細菌及其產物如何促進脂肪變性、肝炎、纖維化、肝硬化和致癌作用的機制研究[11]。飲食干預介導的代謝性疾病模型在肝病的研究中有重要的作用，但同時飲食也是腸道菌群的重要影響因素，不同的造模時間可能對糖代謝和腸道菌群產生影響。本文通過研究高脂飲食誘導的MAFLD小鼠在不同時期血糖和腸道菌群的改變，為研究和建立高脂飲食MAFLD小鼠模型提供參考。

本研究采用60%kcal脂肪含量飲食[6]建立MAFLD小鼠模型，與人類NAFLD的代謝特征高度相似[11]，出現肥胖、胰島素抵抗。經過動態監測小鼠血糖水平[7]，為模型建立提供成功依據。經研究發現，隨著高脂飲食時間的延長，小鼠空腹血糖大幅升高。在予以葡萄糖溶液注射后，血糖迅速顯著升高，且維持較長一段時間高血糖水平，這種現象在24周高脂飲食喂養小鼠最為明顯。在注射胰島素后，高脂飲食喂養小鼠血糖下降緩慢且一直維持在較高水平，24周高脂飲食喂養小鼠血糖達到最高且下降緩慢，可能與胰島素敏感性降低，出現胰島素抵抗有關。研究表明MAFLD與胰島素抵抗、肥胖等代謝綜合征有密切的關系。以往有研究顯示，胰島素抵抗會導致MAFLD，而2型糖尿病的重要危險因素就是MAFLD代謝調節能力降低和胰島素抵抗，隨著肝臟對葡萄糖生產的調節作用減弱，2型糖尿病也隨之發生[12,13]。體質量、GTT和ITT均可以在一定程度上反映MAFLD小鼠疾病的嚴重程度，可以作為良好的觀察指標。

本研究結果顯示，隨著小鼠高脂飲食時間的延長，其腸道菌群多樣性增加，可能與致病菌的種類和數量增加有關。經研究發現，在腸道菌群結構方面，高脂飲食小鼠腸道厚壁菌門升高，擬桿菌門下降，厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)比值上升。既往研究發現肥胖與擬桿菌和厚壁菌門的相對豐度變化相關，與肥胖相關的微生物具有增加從飲食中獲取能量的能力，而且這種特性是可以傳遞的[14]。疣微菌門的顯著下降與艾克曼菌屬關系密切，后者在高脂飲食前小鼠腸道菌群占比為19%。小鼠接受高脂飲食的時間越長，艾克曼菌占腸道菌群的比例越少。艾克曼菌是粘液層的一種共生細菌，可以利用粘蛋白作為唯一的碳源、氮源和能源。以往有研究表明，艾克曼菌通過調節肝臟脂肪合成和炎癥基因表達預防脂肪肝[15]。研究還發現，艾克曼菌在正常人中比前驅糖尿病患者豐度更高，2型糖尿病的潛在標志物可能是疣微菌門[16]。艾克曼菌可以調節葡萄糖代謝和腸道免疫功能，某些食品成分(如多酚)可能會增加腸道中艾克曼菌的含量[17]，增加艾克曼菌可能有助于二甲雙胍的治療糖尿病作用[18]。因此，在高脂飲食動物艾克曼菌顯著下降是重要的MAFLD特征，從8周開始出現顯著下降，持續保持在低水平，是重要的MAFLD造模指示細菌之一。本研究發現，隨高脂飲食時間的延長，發現一些差異細菌顯著減少，在MAFLD的發生發展過程中可能起著關鍵作用。本研究發現隨高脂飲食時間延長，紅蝽桿菌科-UCG_002屬和杜氏桿菌比率逐漸增加，提示上述細菌可能與MAFLD的氧化應激和代謝表型相關[19]，在一定程度上可以反映MAFLD的嚴重程度。通過檢測上述細菌的比率，將可能成為MAFLD無創檢查評估手段之一。

綜上所述，隨著高脂飲食時間延長，MAFLD小鼠血糖水平升高，腸道菌群多樣性增加，腸道菌群結構發生變化，表現為艾克曼菌和瘤胃球菌科-UCG-014屬顯著下降，紅蝽桿菌科-UCG_002屬和杜氏桿菌增加，提示腸道細菌變化與MAFLD疾病進程相關。本研究對MAFLD小鼠腸道菌群改變進行了動態觀察，為建立以腸道菌群為研究核心的MAFLD小鼠模型提供了一定的參考依據，值得進一步研究。