體外脂肪變L02細胞Notch家族和脂質代謝變化研究*

吳偉杰，陳源文，丁雯瑾，范建高

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發病機制尚不清楚，目前學界最為公認的發病機制為“多重打擊學說”，NAFLD發生發展與炎癥，氧化應激和胰島素抵抗等代謝障礙關系密切，而其中肝細胞內甘油三酯異常沉積便是NAFLD發病過程中的關鍵一環[1]。Notch信號通路是通過相鄰細胞之間配受體結合后釋放Notch受體胞內結構域(Notch intracellular domain， NICD)進入胞核，激活下游轉錄因子Hes-1和Hey-1，轉錄因子結合到靶基因DNA序列上發揮作用[2-4]。研究發現人類肝組織Notch下游轉錄因子活性與NAFLD活動評分(NAS)呈正相關。同時，Notch信號通路能夠激活肝組織對營養敏感的mTorc1通路，增加脂肪從頭合成途徑和肝臟甘油三酯的生成[5、6]。本實驗通過建立體外脂肪變細胞模型并使用Notch信號通路抑制劑觀察了L02細胞Notch1、-2、-3、Hes-1和Hey-1基因水平及其與脂質水平的變化，以探討Notch家族對脂肪變細胞脂質代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器人 正常肝細胞L02由中國科學院上海細胞庫提供；RPMI-1640 培養基和磷酸鹽緩沖液(PBS)均購于美國Hyclone 公司；胎牛血清(fatal bovine serum，FBS)購于以色列Biological Industries 公司；γ分泌酶抑制劑N-【N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alnyl】-S-phenylycine t-butyl ester(DAPT)和棕櫚酸(palmitic acid，PA)均購于美國默克公司；RPS-18內參引物購于中國上海生物工程公司；Trizol試劑和預混型定量用逆轉錄試劑盒購于日本寶日醫公司；qPCR SYBR Green Master Mix購于中國上海翊圣生物科技有限公司；Q3 PCR 擴增儀和Nano Drop 2000 超微量分光光度儀(美國賽默飛公司)；PCR 逆轉錄儀(德國艾本德公司)；chemray240全自動生化分析儀(中國雷杜公司)。

1.2 體外細胞脂肪變模型建立與藥物干預 使用PA 5mM母液和RPMI-1640完全培養基(含10% FBS)配制成含PA 0.1mM、0.25mM和0.5mM的完全培養基作為工作液使用。細胞造模分組：對照組(Con)、PA 0.1mM組、PA 0.25mM組和PA 0.5mM組，待L02細胞在培養皿中密度達到60%～70%時，棄掉原有的培養基，用PBS洗1遍，加入不同濃度的PA工作液處理L02細胞24 h，收集細胞。根據前期實驗結果選擇PA 0.25mM濃度作為造模條件，在PA 0.25 mM濃度下，將DAPT設為0 μM、1μM、2μM、5μM和10μM的干預濃度，其中以DAPT 0μM作為模型組，處理L02細胞24 h，收集細胞。

1.3 細胞Notch家族mRNA水平檢測 采用Trizol提取細胞總RNA，使用預混型定量用逆轉錄試劑盒逆轉錄mRNA。在Primer bank設計引物，由上海生物工程公司合成。使用Q3 PCR擴增儀進行擴增，采用SYBR法，反應條件設定為反應體系20 μL，95 ℃預變性30 s，循環次數40次，依次進行95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s。Notch1上游：5’TGCGAGACCAACATCAACGAGTG3’，Notch1下游：5’TCAGGCAGAAGCAGAGGTAGGC3’，擴增片段長度為94 bp；Notch2上游：5’GTAAGGAGTGCCAATGGACGGATG3’，Notch2下游：5’ATTTCTGCCCTGTGAAGCCTGTG3’，擴增片段長度為120 bp；Notch3上游：5’CGTGGCTACACTGGACCTC3’，Notch3下游：5’AGATACAGGTGAACTGGCCTAT3’，擴增片段長度為109 bp；Hes-1上游：5’TCAACACGACACCGGATAAAC3’，Hes-1下游：5’GCCGCGAGCTATCTTTCTTCA3’，擴增片段長度為153 bp；Hey-1上游：5’GT-TCGGCTCTAGGTTCCATGT3’，Hey-1下游：5’CGTCGGCGCTTCTCAATTATTC3’，擴增片段長度為88 bp；選擇人RPS-18作為內參對照，計算各基因mRNA相對水平(結果以2-ΔΔCt表示)。

1.4 培養上清液轉氨酶檢測 收集細胞上清液，準備谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)/谷丙轉氨酶(alanine transaminase，ALT)的基質液、顯色液，應用終止液(濃縮終止液：雙蒸水=1：9)，吸取待測樣品50 μL，與基質液250 μL混合，37 ℃水浴30 min；加入顯色液250 μL，37 ℃水浴20 min；加入應用終止液2.5 mL，混勻后室溫放置5 min，在505 nm波長測得各管OD值。查詢標準曲線，求得相應的水平。

1.5 培養上清脂質檢測 收集細胞，離心棄凈上清，用PBS洗兩次，加入PBS 100 μL，重懸，超聲破碎細胞，離心取上層上清，使用Chemray240全自動生化分析儀檢測甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(cholesterol，TC)、游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)水平。

2 結果

2.1 不同濃度PA干預細胞Notch家族mRNA水平比較 與對照組比，在0.1mM PA干預下，Notch3 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；在PA 0.25mM濃度干預下，Notch3 mRNA水平顯著降低(P<0.01)，而Hes-1 mRNA水平顯著升高(P<0.01)；在0.5mM PA干預下，Notch3 mRNA水平顯著降低(P<0.01)，而Notch1和Hes-1 mRNA水平顯著升高(P<0.01)，Hey-1 mRNA水平變化與對照組比無統計學差異(P>0.05，表1)。

表1 不同濃度PA干預細胞Notch家族mRNA水平比較

2.2 不同濃度DAPT干預PA處理細胞Notch家族mRNA水平變化 與模型組(DAPT 0μM)處理相比，DAPT 2μM、5μM和10μM干預組Notch家族下游Hes-1和Hey-1 mRNA水平均顯著下調(P<0.01)，而Notch1-3基因水平均未被DAPT顯著抑制(表2)。

表2 不同濃度DAPT干預PA處理細胞Notch家族mRNA水平比較

2.3 各組細胞上清液轉氨酶水平變化 在0.25mM和0.5mM PA處理組，AST水平顯著高于對組【(6.7±2.6 )U/L和(12.4±1.6 )U/L對(2.4±0.1 )U/L，P均<0.01】；同樣地，ALT水平也顯著高于對照組【(5.7±0.8)U/L和(10.3±0.7)U/L對(2.2±0.3 )U/L，P均<0.01】；在0.25mM PA處理細胞，給予1μM、2μM、5μM和10μM DAPT干預24 h，各組AST水平均顯著低于模型組(P均<0.01】，而ALT水平均無顯著變化。

2.4 細胞TG、TC和FFA水平變化 在0.25mM和0.5mM PA處理組，細胞TG水平顯著高于對照組【分別為(0.4±0.04)mmol/g和(0.4±0.04)mmol/g對(0.2±0.02)mmol/g，P均<0.01】；在 0.5mM PA處理組，細胞TC和FFA水平顯著高于對照組【分別為(1.2±0.4)mmol/g對(0.2±0.02)mmol/g和(0.07±0.004)mmol/g對(0.02±0.001)mmol/g，P均<0.01】；在 0.25mM PA處理細胞，經2μM、5μM和10μM DAPT 干預24 h，細胞TG水平顯著低于0μM DAPT處理模型組【分別為(0.03±0.01)mmol/g、(0.04±0.01)mmol/g和(0.02±0.01)mmol/g對(0.07±0.01)mmol/g，P均<0.01】，在10μM DAPT干預組，細胞TC水平顯著高于模型組【(0.2±0.03)mmol/g對(0.1±0.02)mmol/g，P<0.05】，而FFA水平無顯著變化。

3 討論

本實驗發現經PA處理L02細胞，Notch 1、Notch3及其下游Hes-1基因水平發生很大變化。據文獻報道，Notch1和叉頭框轉錄因子O亞型1(FoxO1)可以協同調節肝臟葡萄糖代謝，抑制Notch1和FoxO1基因表達能改善胰島素抵抗小鼠對胰島素的敏感性[7-11]。Notch家族與NAFLD脂代謝變化機制可能部分是通過胰島素信號通路途徑實現的[12]。本實驗還發現經PA處理細胞Hes-1基因明顯被激活。本實驗使用DAPT作為γ-分泌酶底物，可以競爭性與γ分泌酶結合，從而實現間接抑制Notch信號轉導。在PA作用細胞，經DAPT干預，觀察到Notch下游Hes-1和Hey-1基因水平均被顯著抑制，結果提示DAPT能成功阻斷Notch向下游傳導[13-15]。

有研究發現抑制脂肪肝大鼠Notch1能同時降低下游Hes-1表達，使脂質代謝相關基因、脂肪酸合成酶和乙酰輔酶A羧化酶表達下調，從而減輕大鼠脂肪肝和高血糖的發生發展[16-18]。Hes-1可以通過調節某種基因，有效阻斷低密度脂蛋白受體在細胞膜上表達[19,20]。在實驗中，我們通過抑制Notch通路，導致下游Hes-1和Hey-1基因表達下調，檢測發現細胞內甘油三酯沉積減少。本研究表明，Notch在肝細胞脂質代謝過程中具有調節作用，其中Notch1/Hes-1途徑可能是參與脂肪肝發病的潛在機制。因此，Notch信號通路值得進一步探索，是治療肝脂肪變性有希望的靶點之一。

Notch信號依賴于細胞間配體與受體相互識別而發揮作用。肝臟組織內不僅有肝實質細胞，同時也存在肝星狀細胞、庫普弗細胞和血管內皮細胞等。單純在L02細胞的實驗可能不足以解釋生物體內細胞間的相互作用。我們課題組擬在未來開展動物實驗進一步了解Notch信號具體是如何影響肝臟脂代謝變化的，以期對肝細胞脂肪變性的發生機制有新的認知。