棍其勒-13味丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

王秋桐，崔圓圓，王玉華

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，內(nèi)蒙古 呼和浩特010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院）

棍其勒-13味丸由訶子、廣棗、紅花、石膏、石榴、木香、楓香脂、胡黃連、丁香、豆蔻、肉豆蔻、炒馬錢子、沉香十三味藥組成的復(fù)方制劑。臨床功效為鎮(zhèn)赫依，清血熱；用于胸部赫依、血相搏，“赫依”性心肺刺痛，胸悶、氣短等癥。棍其勒-13丸作為蒙醫(yī)醫(yī)院常用的蒙醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，目前沒有相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。為了更好的控制該制劑的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)棍其勒-13味丸進(jìn)行了定性鑒別和定量測(cè)定研究。

紅花具有活血通經(jīng)，散瘀止痛的功效[1]。參閱近幾年中藥紅花的研究文獻(xiàn)，其主要的化學(xué)成分是黃酮類、甾體、酚酸類、雙醇、木脂素、查爾酮、炔類以及揮發(fā)油等[2，3]。查爾酮類成分紅花黃色素是紅花現(xiàn)在已知的主要活性成分，根據(jù)官能團(tuán)的不同，化學(xué)結(jié)構(gòu)的分為紅花黃色素A和紅花黃色素B兩種成分[2]，羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）是紅花中最具藥理活性的水溶性成分，多年來一直是科研的熱點(diǎn)，臨床研究表明，其具有抗凝血、抗氧化、預(yù)防腦缺血、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)等作用，是2020版中國藥典收錄紅花藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)成分之一[4，5]。故選擇HSYA作為指標(biāo)成分，采用HPLC法對(duì)處方中紅花的指標(biāo)性成分HSYA進(jìn)行含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

儀器高效液相色譜儀電子天平電子天平超聲波清洗器超純水系統(tǒng)多功能粉碎機(jī)薄層色譜成像儀電腦UIS生物顯微鏡型號(hào)Waters e2695 Mettler-Toledo MS105DU Mettler-Toledo XPR10 SBL-22DT Heal Force NW15UV FW400A GoodSee-10 XSP-BM-30AD廠家沃特世科技有限公司梅特勒-托利多儀器有限公司梅特勒-托利多儀器有限公司寧波新芝生物科技股份有限公司河南省予華儀器有限公司北京材茂科技有限公司上?？普苌萍加邢薰旧虾１藧勰饭鈱W(xué)儀器制造有限公司

1.2 試劑與試藥

對(duì)照品：HSYA（111838-201403），去氫木香內(nèi)酯（111525-201912）。

對(duì)照藥材：楓香脂（121637-201201），均購于中檢院。

供試品：棍其勒-13味丸（201908001、201908002、201908003），由呼倫貝爾市蒙醫(yī)醫(yī)院生產(chǎn)；自制樣品（20190801）。

試劑：甲醇、乙腈、三乙胺為色譜純，其他為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

取本品，置顯微鏡下觀察：石細(xì)胞無色，橢圓形，壁厚，孔溝細(xì)密（石榴）。脂肪油滴眾多，加水合氯醛試液加熱后漸形成針簇狀結(jié)晶（肉豆蔻）。菊糖團(tuán)塊形狀不規(guī)則，有時(shí)可見微細(xì)放射狀紋理（木香）。橄欖形、橢圓形或類圓形的花粉粒，具3個(gè)萌發(fā)孔，直徑約至60μm，外壁有齒狀突起（紅花）。石細(xì)胞成群，呈長(zhǎng)卵形、類圓形、長(zhǎng)條形或長(zhǎng)方形，孔溝細(xì)密而明顯（訶子）。果皮表皮細(xì)胞成片，表面觀類多角形或類圓形，胞腔內(nèi)含顆粒狀物（廣棗）。不規(guī)則片狀結(jié)晶，無色，有平直紋理（石膏）。具緣紋孔導(dǎo)管，紋孔密，內(nèi)含淡黃色或黃棕色樹脂狀物（沉香）。顯微特征照片見圖1。

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 楓香脂薄層色譜鑒別

取本品2.0g，粉碎，加10mL甲醇，用超聲處理20分鐘，取上清液作為供試品溶液。另取楓香脂對(duì)照藥材0.2g和陰性供試品2.0g，同法分別制成對(duì)照藥材溶液和陰性對(duì)照溶液。點(diǎn)樣量各5μL，薄層板為硅膠GF254薄層板，展開劑為正己烷-乙酸乙酯-石油醚（60～90℃）-冰醋酸（6：3：2：0.2），檢視方式為在紫外燈（254nm）下檢視。薄層色譜圖見圖2。

圖2的結(jié)果顯示，楓香脂對(duì)照藥材溶液顯示1個(gè)主斑點(diǎn)，供試品溶液在與其對(duì)應(yīng)位

圖2 楓香脂TLC鑒別圖Tab.2 Liquidambar Formosana Hance TLC Identification Chart

置處顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定沒有干擾。

2.2.2 木香薄層色譜鑒別

取本品2.5g，粉碎，加10mL甲醇，用超聲處理0.5小時(shí)，過濾，作為供試品溶液。另取去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品，加甲醇制成0.5mg/mL的對(duì)照品溶液。取陰性供試品2.5g，同法制成陰性對(duì)照溶液。點(diǎn)樣量各5μL，薄層板為硅膠G薄層板，展開劑為環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸（15：5：1），檢視方式為噴1%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。薄層色譜圖見圖3。

圖3的結(jié)果顯示，去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品溶液顯示1個(gè)斑點(diǎn)，供試品溶液在與對(duì)照品溶液Rf值相同的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定沒有干擾。

圖3 木香TLC鑒別圖Tab.3 Aucklandia lappa Decne TLC Identification Chart

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件

色譜條件色譜柱流動(dòng)相檢測(cè)波長(zhǎng)柱溫流速進(jìn)樣體積參數(shù)Agela Venusil XBP C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）甲醇-乙腈-0.7%磷酸（用三乙胺調(diào)pH為6.04）（28：2：70）403 nm 30℃1.0 mL·min-1 10 μL

2.3.2 溶液的制備

將本品粉碎，精密稱取1.7g，精密加25%甲醇25ml，稱重，超聲40分鐘，放冷，再稱重，用25%甲醇補(bǔ)，離心5分鐘（轉(zhuǎn)速7000r/min），取上清液作為供試品溶液。再取HSYA對(duì)照品，加25%甲醇制成56.79μg/mL的對(duì)照品溶液。取陰性供試品1.7g，同法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

2.3.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下將上述制備的三種溶液進(jìn)液相測(cè)定，記錄色譜圖。色譜圖見圖4。

圖4 專屬性試驗(yàn)色譜圖Tab.4 Exclusive experiment chromatogram

圖4結(jié)果顯示，在相同的保留時(shí)間處，供試品和對(duì)照品色譜圖中均有色譜峰出現(xiàn)；陰性對(duì)照色譜圖無色譜峰出現(xiàn)，專屬性強(qiáng)。

2.3.3.2 線性關(guān)系考察

取上述制備的對(duì)照品溶液，分別精密吸取2μL、5μL、10μL、15μL、20μL和25μL進(jìn)液相測(cè)定，以峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行分析，結(jié)果見表1和圖5。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Tab.5 Standard curve chart

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)值表Fig.1 Standard curve value table

結(jié)果線性關(guān)系較好，回歸方程y=3228006.9390x-116997.8884（r=1.0000）。

2.3.3.3 精密度試驗(yàn)

取一份供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6針進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果HSYA峰面積值的RSD為0.63%。儀器精密度好。

2.3.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取一份供試品溶液，分別在溶液制備后的0、2、4、8、10和12小時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果HSYA峰面積值RSD為1.27%。表明12小時(shí)內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.3.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)（批號(hào)201908001）供試品6份，制成供試品溶液后進(jìn)樣分析，計(jì)算含量。結(jié)果HSYA的平均含量為0.87mg·g-1，含量RSD值為0.29%。該方法的重復(fù)性好。

2.5.6 加樣回收試驗(yàn)

取供試品（批號(hào)201908001，含量為0.87 mg·g-1）9份，精密稱取0.85g，分成三組，每組三份，每組分別精密加入約相當(dāng)于供試品含有量的50%、100%、150%的HSYA對(duì)照品及25%甲醇25mL，再按上述方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算含量并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果表Fig.2 Test results of Sample recovery test

表2結(jié)果顯示，HSYA的平均回收率為101.1%，RSD為2.05%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠。

2.5.7 耐用性試驗(yàn)

取供試品兩份，按上述擬定的方法制備供試品溶液，用不同廠家色譜柱和柱溫箱子不同溫度下進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果在使用不同廠家的色譜柱測(cè)定時(shí)，HSYA色譜峰分離度均良好，且其含量測(cè)定結(jié)果之間沒有顯著差異。在柱溫箱溫度不同（25℃、30℃、35℃）的情況下對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較小，耐用性好。

2.5.8 樣品含量測(cè)定

取3批樣品和1份自制樣品（批號(hào)201908001，201908002，201908003，201908010）各2份，制備供試品溶液后進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果見表3。

表3 含量測(cè)定結(jié)果表Fig.3 Assay result

表3的結(jié)果顯示，3批棍其勒-13味丸樣品中HSYA含量很接近，自制樣品含量稍高些。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的調(diào)整

參照《中國藥典》2020年版一部“紅花”項(xiàng)下的測(cè)定方法[1]，選擇甲醇-0.7%磷酸-乙腈（26：72：2）為流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但HSYA峰型不對(duì)稱且拖尾嚴(yán)重。加三乙胺調(diào)節(jié)0.7%磷酸溶液pH值至6.0后，供試品色譜圖中的HSYA峰的對(duì)稱性由拖尾變成前沿峰，故調(diào)整流動(dòng)相比例為甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（28：2：70）。此時(shí)HSYA色譜峰的拖尾因子在0.95-1.05之間且與相鄰峰達(dá)到較好分離，理論板數(shù)較高，并具有適宜的保留時(shí)間。經(jīng)以上試驗(yàn)確定流動(dòng)相為甲醇-乙腈0.7%磷酸水溶液（28：2：70）[6～8]。流動(dòng)相中的0.7%磷酸水溶液的pH值為6（用三乙胺調(diào)節(jié)）。

3.2 樣品粉碎粒度的選擇

以《中國藥典》2020年版一部“紅花”含測(cè)項(xiàng)下的粉碎細(xì)度為參考依據(jù)，確定本品粉碎細(xì)度為研細(xì)后過三號(hào)篩。

3.3 溶劑用量的確定

《中國藥典》2020年版一部“紅花”含測(cè)項(xiàng)下的紅花稱樣量為0.4g，加提取溶劑50mL。根據(jù)棍其勒-13味丸處方總量和處方中紅花的量計(jì)算，稱取棍其勒-13味丸1.7g含紅花藥材0.2g，故選擇加提取溶劑25mL。

3.4 超聲提取時(shí)間的選擇

為確定超聲提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響，本試驗(yàn)研究比較了提取時(shí)間為30 min、40 min和50 min時(shí)的提取效率。結(jié)果超聲提取30 min時(shí)含量偏低，超聲提取40 min和50 min時(shí)，含量基本相同。故確定超聲時(shí)間為40 min。