硫酸軟骨素及其衍生物的應用研究進展

萬劍飛 朱依諄 段小群

【摘要】綜述了近年來硫酸軟骨素及其衍生物的制備、分離純化、衍生化和應用研究等方面的研究進展。

【關鍵詞】硫酸軟骨素;制備;衍生化;應用研究

硫酸軟骨素（CS）/硫酸皮膚素（DS）是天然大分子，是屬于糖胺聚糖（GAG）類的主要雜多糖，是僅次于硫酸乙酰肝素（HS）的第二大異質性GAG組，在功能上表現為細胞周基質、細胞內環境和細胞外基質（ECM）中的CS蛋白聚糖（CSPG）。CS因硫酸基的數目和位置可衍生出CS的各種異構體，其中最為常見的是CSA（4-O-硫酸基）和CSC（6-O-硫酸基）。

幾十年來，人們一直在研究CS修飾物在癌癥進展中的作用。在實體瘤中，CS 參與促進腫瘤細胞粘附而促進惡性細胞的侵襲和轉移行為;在胚胎發育期間，CS在CSPGs中具有重要的形態發生的功能。為了進一步優化CS的生物活性，將CS進行不同程度的衍生化并探討其應用前景。

1、制備

1.1 提取法

動物提取法主要是堿提取法、酶提取法、沉淀法、超聲法及有機溶劑沉淀法等，但制備的產品均為粗品。單一的提取方法主要存在周期長、污染重、時間長等問題。

1.2 發酵法

CS不僅是脊椎動物細胞外基質中極其重要的糖胺聚糖（GAG），還是一種包含幾種細菌的莢膜多糖。CS仍然從有限且可能有害的動物中提取，例如雞龍骨、魚翅和豬或牛的氣管。目前采用大腸桿菌K4或其在不同背景下的生物發酵和合成機制來生成用于生產軟骨素的細胞工廠，并獲得了較好的成果。

泌尿病原體菌株的莢膜多糖由N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）和葡萄糖醛酸（GlcA）的交替殘基組成，其結構與CS的骨架非常相似。不同之處在于GlcA殘基上是否存在果糖和硫酸根。

與CS相比，由重組大腸桿菌K4產生的軟骨素（BC）進行了評估，結果顯示：IL-1b處理的軟骨細胞中炎癥反應降低程度更高，并增強了它們的增殖和表型保存。此外，最近完成了通過果糖分支裂解和選擇性硫酸化將生物技術軟骨素化學轉化為CS。然而，培養基中的大腸桿菌K4也會釋放脂多糖，這些脂多糖是主要的產品污染物，需要在純化中去除。

2、分離純化

分離純化CS的方法有很多，如季銨鹽法、離子交換法以及超濾—離子層析法等。

Gábor Tóth等在HILIC的分離中使用鹽梯度，提供了相對快速的色譜，同時具有出色的靈敏度（15分鐘循環時間，10-20fmol/μL檢測，30-50fmol/μL定量限）和良好的線性。通過測量健康、肝硬化和癌變肝臟樣本的人體組織切片，證明了新方法的有效性。

魏明等采用回收制備型HPLC來分離和純化硫酸軟骨素寡糖（CSO），并通過多階段程序衍生化來獲得硫酸軟骨素。

Léna Jaravel等采用毛細管等速電泳分離純化硫酸化二糖，再通過CZE、串聯質譜和IRMPD光譜的離線耦合對CS進行結構表征。該方法優化了毛細管電泳的分離條件，充分分離對兩種CS二糖異構體。

相比于傳統的超濾法或離子交換法，采用上述三種方法可以精細的提取CS，所獲得的產率和純度都較傳統方法高出很多。

3、衍生化

3.1 低硫酸化

天然CS都是高分子量化合物，其生物利用率低，不易被體內吸收。MartelPelletier等表明低分子量CS可能更容易被吸收。因此選擇不同的方法降解CS至關重要，目前主要有酸水解法、酶解法、氧化降解法以及微波輔助堿法。

3.2 多硫酸化

通過控制反應條件將CS進行過硫酸化，可以得到具有不同分子量和不同硫酸化的硫酸化軟骨素。雖然發現CS具有最小的抗凝活性，但增加硫酸鹽化水平會產生抗凝反應。姬勝利等采用氯磺酸和甲酰胺修飾CS，在改進工藝的同時，也增強了產品的抗凝活性和抗血栓能力。

3.3 脫乙酰化

通過肼基化反應對CS的氨基己糖脫乙酰化，得到游離態的氨基和糖基化CS。Nadkarni等通過對CS進行硫酸肼催化從而得到脫乙酰的CS，且制備的產品獲得了75%的產率。

3.4 酯化

通過酯化反應可以有效降低硫酸軟骨素B（DS）的抗凝效果，Barzu等先用DS和四丁基銨反應得到DS—四丁基銨鹽，再將其分別與鹵代烴和鹵化芐等反應，得到一系列DS的酯化衍生物。通過對這些衍生物的研究發現，芐基酯的抗凝活性顯著降低，但其抗HIV的活性沒有發生變化，因此，該類酯化衍生物可作為抗HIV的潛在藥物。

3.5 酰化

Park等采用吡啶作為催化劑，將CS與不同分子量的乙酸酐反應，得到一些不同乙酰化程度的CS乙酰化產物。通過研究表明，將這些CS乙酰化產物制備成凝膠能有效結合抗癌藥物阿霉素，因此，該乙酰化產物可以作為抗癌藥物的載體并投入臨床應用。

4、應用研究

4.1 抗腫瘤

在腫瘤生態位中積累的CS可以通過各種宿主細胞（如成纖維細胞或白細胞）的粘附來間接影響癌細胞的侵襲。這些細胞是生長因子和ECM降解酶的重要來源，可刺激癌細胞遷移。此外，CS可以調節腫瘤生態位的ECM結構從而影響癌細胞的傳播。

目前CS在癌癥的進展中研究表明：由于其抗炎特性，CS可以作為一種緩效抗炎藥來預防癌癥。此外，考慮到其與CD44相互作用的能力，CS可以作為治療靶點，以減少宿主細胞對癌癥生態位的浸潤，這些細胞被假設為癌細胞中耐藥性的主要介質。另一方面，由于其帶負電荷并與多種細胞表面受體（如HARE或上述CD44）結合，CS或其鏈片段也可用作藥物遞送載體提高抗癌治療的特異性和效率。

4.2 抗炎癥

CS直接或間接調節抗炎作用，CS是一個大分子，不能穿透軟骨細胞，因此它通過與膜受體結合而被內化為寡糖或二糖，通過結合CD44和ICAM1促進IL-1受體相關激酶-M（IRAK-M）（一種IRAK抑制劑）或MKP-1的釋放，從而使MAPK去磷酸化。這些作用將減少NF-κB核易位和炎癥反應。

軟骨和滑液的基本成分是CS，它通過促進二型膠原蛋白和蛋白多糖的合成來誘導軟骨代謝。軟骨血管的生成要歸結于軟骨中丟失的CS，這是OA的主要原因。CS作為SYSADOA，在3個級別的骨關節炎（OA）修復中：關節軟骨、滑膜、軟骨下骨。CS能夠調節滑膜成纖維細胞和軟骨細胞的功能，因此，它有望成為一種用于OA的多功能軟骨保護材料。

4.3 新型載藥系統

基于多糖新型藥物輸送系統已經獲得了巨大的成功。在過去幾年中，大量基于CS的新型藥物遞送系統以配體或藥物的形式出現。據報道，CS的各種組合可用于治療OA，例如CS4和CS6與葡萄糖胺，葡萄糖胺和抗氧化劑微量營養素，透明質酸，槲皮素衍生物，或飲食補充劑，如葡萄糖胺、抗氧化劑和綠唇貽貝、GLU、CS與二十碳五烯酸 （EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和綠唇貽貝提取物等。

綜上所述，硫酸軟骨素及其衍生物的開發仍有很大的前景。目前市場上的硫酸軟骨素仍然采用化學方法提取，力求改進生產工藝，減少污染，降低成本。在目前研究中表明，多硫酸化硫酸軟骨素（PSCS）通過延長凝血時間和增強血漿中的凝血酶抑制作用而作為抗凝劑使用。盡管向硫酸軟骨素中添加額外的硫酸鹽增加了抗凝血活性，但當硫酸化從3.0增加到4.0時，用肝素輔因子II測量的抗凝血活性降低，因此，適當的修飾可以增強其相關活性。開發活性較好的CS衍生物是增強CS活性的一種不錯的方式，并將其廣泛應用于食品、工業生產以及醫療器械中。

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