小脊椎動物骨骼透明標本制作條件的探討

陳文芳，桂文龍，顏 衛，孟欣欣，錢逸雪，霍英卓，蔣志偉

（江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300）

骨骼透明標本的制作過程受多種因素的影響，近年來對動物骨骼透明標本的制作和應用越來越廣泛，制作方法也層出不窮，但對其制作過程的條件探討很少，本試驗通過采用茜素紅單染色法探討不同的室溫和不同的堿液濃度對小脊椎動物骨骼透明標本制作效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小脊椎動物 實驗所用活體小脊椎動物（蛙類、幼鼠、魚類）均由江蘇農牧科技職業學院實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑 氫氧化鉀、無水乙醇，丙酮（分析純，濃度為99.7%），丙三醇（分析純，濃度為99.0%），茜素紅，蒸餾水。

1.1.3 器材 解剖器械、燒杯、量筒、膠頭滴管、玻璃棒、托盤天平、廣口瓶、標本瓶。

1.2 溶液配制 Y1 系列：將無水乙醇和蒸餾水分別按70%、80%、90%、100%的濃度梯度配制。

Y2 系列：將氫氧化鉀和蒸餾水分別按1%KOH、2%KOH、3%KOH的濃度配制。

Y3：茜素紅0.01 g，KOH 1.0 g，蒸餾水100 mL，混合均勻。

Y4：丙三醇20 mL，KOH 1.0 g，蒸餾水80 mL，混合均勻。

Y5 系列：將丙三醇和蒸餾水分別按50%、75%、100%的濃度梯度配制。

1.3 方法

1.3.1 選材分組 分別在冬、春季和夏季不同室溫條件下，選擇活體牛蛙（200 g 左右）、出生一周內的幼鼠、15～20 cm 長的鯽魚和成年觀賞金魚四種小脊椎動物各12只，隨機均分成3組，每組4只，按不同的溶液濃度分別操作。

1.3.2 標本預處理 將新鮮完整的活體小動物分別進行預處理。蛙類用金屬探針插入活體枕骨大孔，破壞腦脊髓處死，在腹部正中位置切開小口去除內臟，將標本沖洗干凈；魚刮去鱗片，打開腹腔去除內臟，清洗干凈；出生一周內的小鼠，用乙醚麻醉后，打開腹腔取出內臟，清洗干凈。

1.3.3 固定 將預處理好的標本放入95%酒精中固定，以確保標本的良好形態，魚標本用線綁在玻璃片上，使它的姿勢呈自然狀態。液面沒過標本，并將標本盡可能伸展，隨時觀察固定情況，直到標本骨骼稍硬、可隨意翻動為止。

1.3.4 脫水 將標本依次浸泡在80%、90%、100%的Y1系列溶液中，每種濃度溶液浸泡3～7 d。

1.3.5 脫脂 根據標本實際情況選擇脫脂，將脫水后的標本在丙酮內脫去脂肪，時間為2～4 d，中間換液1次。

1.3.6 透明 把脫水的標本放入Y2 系列溶液中進行初步的腐蝕透明，隨時觀察透明情況，中間可根據標本情況更換一次腐蝕軟化透明液，直到標本呈半透明狀態、能隱約看到骨骼時為止。

1.3.7 染色 把初步半透明的標本放入Y3 溶液中浸泡，使茜素紅著色于骨骼。在浸泡過程中隨時觀察著色情況，直到骨骼染成紫紅色為止。著色快慢與標本情況有關。

1.3.8 初步脫色 將標本從Y3 溶液中取出放置于Y4 溶液中浸泡，使染色的軟組織脫色變成白色，直到骨不變色為止。

1.3.9 深度脫色 將標本從Y4 溶液中依次放置于Y5系列梯度脫色液中，逐步繼續脫色，使軟組織逐漸變為無色，直到骨組織清晰可見為止。脫色過程中根據脫色液的渾濁程度決定是否更換更高濃度的脫色液。

1.3.10 保存 將脫色好的標本放入純甘油（丙三醇）中保存。

2 結果

2.1 堿溶液濃度的影響 在標本染色前的處理中，不同的KOH溶液濃度對標本腐蝕軟化透明的時間有較大的影響，如表1所示。

表1 不同的KOH濃度對小動物骨骼軟化透明效果的影響（室溫5～20 ℃）

從表1可以看出，在相同的環境溫度下，同一小脊椎動物在不同的KOH 濃度中達到軟組織呈半透明狀態、隱約看到骨骼的理想效果，在時間上有較大的差距。隨著溶液濃度的增加，每種動物軟化透明的速度加快。

2.2 環境溫度的影響 在標本的處理、染色和脫色過程中，環境溫度均對其制作時間有較明顯的影響，如圖1～圖4所示。

圖1 不同室溫對標本固定時間的影響（d）

圖2 不同室溫對標本染色時間的影響（d）

圖3 不同室溫對標本脫色時間的影響（d）

圖4 不同室溫對標本透明時間的影響（d）

在較低的氣溫條件下，幾種小脊椎動物標本固定、染色、脫色和透明制作環節的時間都比較長，隨著室溫升高，制作時間均明顯縮短。同等條件下體積最大的鯽魚在不同室溫下的制作時間最長，體積最小的金魚制作時間最短，蛙和仔鼠的制作時間介于鯽魚和金魚之間。故正常室溫條件下，溫度越高標本制作時間越短，體積越大標本制作時間越長。

3 討論

3.1 試劑選擇 本試驗在試劑的選擇上選用了成本低、對人體傷害小、效果較好的試劑，如在固定環節選用酒精固定液，因為酒精具有使材料硬化和脫脂的雙重作用［1］；在染色前選用梯度濃度酒精和丙酮進行脫水脫脂處理［2］；選用既能軟化透明軟組織又能增加染料滲透力的KOH 堿液［3］；選用對骨骼染色有特異性的茜素紅染色劑［4］；透明劑則選用低成本又無毒的甘油［5］。

3.2 材料預處理 在標本的預處理中動物的剝皮與否取決于標本制作時間快慢的選擇，本試驗為了保持標本的整體輪廓沒有做剝皮處理，標本整體效果較好。標本預處理時應注意保持標本的完整性，尤其不要損害骨骼。

3.3 堿液濃度選擇 低濃度的堿液提高了組織的通透性，使染色液和甘油的滲透力增強。但在濃度的選擇上應根據實際情況，一方面氫氧化鉀堿液具有腐蝕作用，隨意提高濃度會使標本受到破壞，因此堿液濃度要從低至高逐步增加；另一方面采用較高濃度的氫氧化鉀堿液軟化，其間必須隨時嚴格觀察，以免短時間內腐蝕過度而破壞組織。在軟化透明過程中要注意觀察不能透明過久，否則肌肉會腐蝕過度，變軟甚至離散。

3.4 效果判斷方法 選用眼觀變化比較明顯的環節，如在標本固定環節可以直接觀察和觸碰其固定效果，在軟化透明環節可以觀察標本的肌肉膨脹透明程度，在染色環節可以觀察骨骼的染色程度，在脫色環節可以觀察軟組織的脫色情況等。

4 小結

本試驗分別在我國東南部的冬、春、夏三個季節自然氣候條件下進行，通過對幾種小脊椎動物的對比研究，發現氣溫較高的夏季，骨骼透明標本的制作時間明顯較短，染色效果也較好，而冬季每一步操作的時間都延長，染色效果一般。

不同的標本有不同的最佳堿液濃度，1%KOH溶液適用于體積很小、軟組織較少的標本，3%KOH 溶液適用于軟組織較厚、體積較大的標本，而濃度大于3%的氫氧化鉀溶液不適用于組織的軟化透明。本試驗得出：鯽魚標本選擇3%KOH、金魚標本選擇1%KOH，而仔鼠和蛙標本選擇2%KOH較為合適。

動物骨骼透明標本的制作周期、標本質量及觀察效果除了受環境溫度、動物體質量、堿性試劑濃度等關鍵因素的影響外，標本最終的染色效果還與固定液濃度和時間、脫水脫脂液濃度等密切相關，同時受動物年齡大小、動物體型大小、環境濕度等因素的直接影響。