大蒜素對SD大鼠深Ⅱ度燙傷創面治療作用及機制

陳 強， 梁哲勇， 屈航英， 鐘 亮， 郜 揚， 郝軍軍， 馬 濤， 韓 丹

西安交通大學第一附屬醫院 心血管外科，陜西 西安 710061

大蒜為百合科植物，其鱗莖用于防治疾病已有悠久歷史[1]。近年來，有關大蒜的化學藥理研究得到了廣泛的重視，并且取得了突破性的進展[1-2]。大蒜素化學名為二烯丙基三硫化物，分子式為C6H10S3，相對分子量為178.3，是大蒜內的蒜氨酸在蒜酶的作用下酶解形成的活性成分[3]。多項研究表明，大蒜素具有抗氧化、抗病原微生物、抗炎、清除自由基、抗腫瘤細胞增生、調控細胞凋亡、降低膽固醇、抗血栓形成等作用[4-6]。深Ⅱ度燙傷是臨床上較為常見的一種燙傷類型，累及真皮乳頭層以下，但仍殘留部分網狀層，深淺不一，易發生嚴重的炎癥反應，且易合并感染。有研究證實，燒燙傷導致皮膚發生炎癥及代謝異常的機制與內質網應激有關[7]。本研究采用SD大鼠深Ⅱ度燙傷模型探討大蒜素治療深Ⅱ度燙傷創面的作用及機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠50只，體質量(250±10)g，成年雄性，提供機構為西安交通大學醫學院實驗動物中心。取材前，所有大鼠飼養1周，正常飲食，自由飲水，環境12：12光暗循環，溫度18～25℃，濕度45%～65%，氨濃度<20 mg/L，換氣量1.27 m/h。

1.2 試劑及儀器 顯微鏡(日本OLYMPUS，CX31-12C04)；石蠟切片機(德國Leica，RM2235)；電熱水器；溫度計；量筒(200 ml)；HE染液；京萬紅燙傷膏(天津達仁堂京萬紅藥業有限公司，Z12020440)；欣帝大蒜素注射液(濟南利民制藥有限責任公司，H20046064)；芝麻油；生理鹽水；白細胞介素(interleukin，IL)-6試劑盒、IL-10試劑盒、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒(上海生工生物)；β-actin抗體、PERK抗體、P-eIF2α抗體、CHOP抗體、Bax抗體、Caspase-12抗體、Bcl-2抗體、Cleaved Caspase-3抗體(美國CST)；BCA蛋白定量試劑盒(美國賽默飛)。

1.3 實驗方法

1.3.1 配制大蒜素油 以大蒜素注射液為母液，用無菌芝麻油分別將母液稀釋為10%、5%、1%的濃度。

1.3.2 燙傷模型制作 將50只SD大鼠隨機分為A、B、C、D、E組，每組各10只。各組大鼠造模前根據體質量以0.3 ml/100 g腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液實施麻醉。待大鼠麻醉后，取硫化鈉溶液在大鼠背部脫毛，并用生理鹽水擦凈脫毛液。將盛90℃熱水的量筒底部置于大鼠背部15 s，面積接近10%總體表面積，構建深Ⅱ度燙傷模型[8]。見圖1。燙傷模型構建好后立即生理鹽水5 ml腹腔注射。大鼠醒后分籠飼養，自由進食飲水。A組涂抹芝麻油作為陰性對照組，B組涂抹京萬紅燙傷膏作為陽性對照組，C、D、E組分別涂抹10%、5%、1%大蒜素油。

圖1 大鼠深Ⅱ度燙傷模型制作

1.3.3 燙傷創面處理 燙傷6 h后對大鼠進行給藥處理，在大鼠清醒條件下，對創面進行雙氧水消毒，再根據分組分別將0.5 ml不同濃度大蒜素油、1.0 g京萬紅燙傷膏、0.5 ml芝麻油均勻涂抹在大鼠的燙傷創面上，給藥頻次為12 h 1次，連續給藥直至大鼠創面全部愈合。每天觀察燙傷創面具體愈合狀態，記錄潰破、滲出、感染情況，以全部上皮覆蓋作為創面愈合的標志。

1.3.4 標本取材及處理 燙傷后12 d，取創面組織標本固定在4%甲醛溶液內，石蠟包埋后切片，HE染色，光鏡下觀察組織學特征。

1.3.5 分子生物學檢測 燙傷創面MDA、SOD、CAT含量測定：取0.1 g燙傷創面組織加入生理鹽水制成10%組織勻漿，置離心管中以3 000 r/min離心15 min，取上清液，硫代巴比妥酸法測定MDA，黃嘌呤氧化酶法測定SOD，高錳酸鉀滴定法測定CAT。血清IL-6、IL-10、TNF-ɑ水平測定：將大鼠眼球血以3 000 r/min離心15 min，取上清液酶聯免疫法測定血清IL-6、IL-10、TNF-ɑ水平。

1.3.6 Western Blotting檢測 每1 ml蛋白裂解液RIPA中加入20 μl(50×)蛋白酶抑制劑儲存液，使抑制劑終濃度為1 mmol/L。取0.1 g燙傷創面組織加入上述蛋白裂解液制成組織勻漿，冰上孵育0.5 h，3次旋渦振蕩，4℃下12 000 r/min離心30 min(半徑為12 cm)，將上清液轉移至干凈EP管內，BCA法檢測各組樣本中的蛋白質濃度，分裝后置于-80℃冰箱保存。取40 g蛋白樣品進行電泳，然后轉移至硝酸纖維膜，50 g/L牛血清白蛋白TBST緩沖液室溫封閉硝酸纖維膜，再加入不同的一抗孵育4℃過夜。TBST緩沖液3次洗滌后加入二抗孵育1 h，TBST緩沖液3次洗滌膜后加入ECL發光液，曝光，成像。軟件檢測各條帶灰度值，結果用目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

2 結果

2.1 各組大鼠創面愈合情況比較 用藥后12 h，C、D組創面淤血呈斑塊狀散開，其他組創面淤血仍為片狀。3 d內，各組創面均紅潤；3 d后，D組創面水腫、淤血大多消失不見。隨著給藥時間延長，C、D組肉芽組織明顯生長，創面縮小顯著。B、C、D、E組創面均未出現感染；A組創面部分出現紅腫，創面痂下有積膿出現。7～11 d，B、C、D、E組創面痂皮出現大量脫落，創面逐漸與皮面平整，基本填充了肉芽組織；而A組創面痂皮僅出現部分脫落，創面低于皮面，可以發現薄層肉芽。12 d時，B、C、D、E組創面大部分已愈合，而A組創面愈合時間出現了一定程度的延遲。5組中，D組創面愈合時間最短(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠燙傷創面愈合時間比較

2.2 各組大鼠創面病理切片結果比較 傷后12 d取創面組織標本制作病理切片光鏡下觀察。C、D、E組鏡下可見上皮明顯增生且較為完整，已近似于正常鱗狀上皮，真皮淺層部位可發現少量炎癥細胞浸潤，存在輕微炎癥反應，殘存毛囊可見再生修復。A組可見上皮增生不明顯且不完整，表面可見滲出物形成的結痂，部分表皮壞死層附著，炎癥細胞開始減退，部分創面出現感染，大量炎癥細胞浸潤，炎癥反應明顯，創面出現一定程度的加深，可累及至真皮的深層殘存附件。B組上皮增生明顯但不完整，可見增生的上皮呈舌狀，上皮細胞輕度水腫，真皮淺層發現浸潤大量炎癥細胞，炎癥反應較為明顯。見圖3。

圖3 各組大鼠創面病理切片(a.A組；b.B組；c.D組)

2.3 各組大鼠創面組織MDA、SOD、CAT水平比較 D組MDA水平低于A組和B組，B組低于A組，差異均有統計學意義(P<0.05)。D組SOD、CAT水平高于A組和B組，B組高于A組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠創面組織MDA、SOD、CAT水平比較

2.4 各組大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平比較 D組IL-6、TNF-ɑ水平低于A組和B組，B組低于A組，差異均有統計學意義(P<0.05)。D組IL-10水平高于A組和B組，B組高于A組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平比較

2.5 各組大鼠創面組織蛋白表達程度比較 與A、B組比較，D組PERK、P-eIF2α、CHOP蛋白表達程度顯著降低(P<0.05)。見圖4。與A、B組比較，D組Bax蛋白表達程度顯著降低，Bax/Bcl-2下降(P<0.05)。見圖5。與A、B組比較，D組Caspase-12、Cleaved Caspase-3蛋白表達程度顯著降低(P<0.05)。見圖6。

圖4 各組大鼠創面組織PERK、P-eIF2α、CHOP蛋白表達

圖5 各組大鼠創面組織Bax、Bcl-2蛋白表達

圖6 各組大鼠創面組織Caspase-12、Cleaved Caspase-3蛋白表達

3 討論

制作動物皮膚燙傷模型的方法很多，激光、恒溫恒壓電燙儀、手提壓力蒸汽消毒器等可通過精確控制溫度、壓力、時間及燙傷面積獲得恒定的、有重復性的燙傷模型，但方法較為復雜，成本高，使用不方便。本研究參考相關文獻[8]，找到了一種利用量筒、溫度計、電熱水器制作的可控溫度、壓力及面積的大鼠燙傷裝置，其不僅能夠達到獲得不同深度燙傷模型的要求，還具有簡單、經濟、使用方便、重復性好等優點。

燒燙傷創面的主要致病菌為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌，且耐藥現象嚴重[9]。大蒜素是一類廣譜抗菌藥，能夠抑制和殺死大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，以及包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌在內的多種耐藥菌[10-12]。但大蒜素對皮膚有較強的刺激作用，高濃度大蒜素直接用于創面會引起劇烈疼痛，用芝麻油稀釋大蒜素可降低大蒜素的不穩定性，減輕臭味和對皮膚的刺痛腐蝕作用，同時增加大蒜素的皮膚滲透性。因此，本研究將大蒜素溶于芝麻油，制成不同濃度的大蒜素油。本研究結果顯示：5組大鼠中，D組創面愈合時間最短(P<0.05)；C、D、E組傷后12 d病理切片光鏡下可見創面無感染，炎癥反應輕。即接受5%大蒜素油處理大鼠的創傷愈合時間最短，效果最好。10%大蒜素油效果不及5%的原因可能為高濃度大蒜素對新生肉芽組織具有一定的刺激性。

大蒜素對燙傷創面愈合的促進作用可能與其抗炎作用、抗氧化應激作用有關。在動物實驗中，大蒜素可抑制二甲苯性小鼠耳廓腫脹和大鼠蛋清性足腫脹的急性滲出性炎癥[13-14]。有研究表明，大蒜素能夠抑制TNF-α、誘導型一氧化氮合酶及其產物一氧化氮、核因子κB、粘附分子的表達，調節IL，發揮抑制炎癥反應的作用[15-17]。在炎癥的病理條件下，白細胞分泌大量超氧負離子，其通過自發歧化作用轉化為H2O2，大量的超氧負離子和H2O2可通過Fenton型Haber-Weiss反應產生損傷作用更強的羥自由基，羥自由基會進一步造成核酸、蛋白質及脂質損傷。有研究發現，大蒜素具有抗氧化、清除自由基的作用，能夠對炎癥引起的自由基損傷起到一定保護作用[18-21]。本研究結果顯示：D組IL-6、TNF-ɑ水平低于A組和B組，B組低于A組，差異均有統計學意義(P<0.05)；D組IL-10水平高于A組和B組，B組高于A組，差異均有統計學意義(P<0.05)。即5%大蒜素油可顯著減少燙傷大鼠血清中IL-6、TNF-α，增加IL-10，這提示，大蒜素對深Ⅱ度燙傷創面具有抗炎作用。此外，燒燙傷創面發生不完全氧化會產生大量活性氧，抗氧化酶SOD、CAT過度消耗也會導致活性氧蓄積，引起氧化應激反應。SOD是活性氧在生物體內的高效催化劑，SOD催化活性氧發生還原反應生成H2O2，而CAT可以進一步還原H2O2生成水和氧，因此，SOD、CAT對調節活性氧平衡至關重要[22]。MDA是活性氧氧化脂質反應的終產物，在一定程度上反映活性氧的代謝程度[23]。本研究中：D組MDA含量低于A組和B組，B組低于A組，差異均有統計學意義(P<0.05)；D組SOD、CAT含量高于A組和B組，B組高于A組，差異均有統計學意義(P<0.05)。即5%大蒜素油可顯著降低燙傷組織中MDA含量，提高SOD、CAT活性，這提示，5%大蒜素油對大鼠深Ⅱ度燙傷創面的氧化應激具有抑制作用。

內質網應激是細胞調節蛋白質穩態、鈣離子平衡、脂質代謝、炎癥反應及保護細胞功能的重要病理生理過程[24]。內質網膜上的PERK分子是內質網應激調控蛋白質穩態、維持線粒體正常生理功能及細胞內環境的重要組成部分。病理狀態下，內質網應激PERK信號通路被激活，上調CHOP、Bax等表達，導致線粒體結構功能障礙，釋放活性氧等凋亡因子。過量的活性氧會活化促炎癥蛋白酶Caspase-1，使IL-1β、IL-6等炎癥因子異常增加，促進細胞凋亡及炎癥性壞死[25]。有研究報道，燒燙傷可激活內質網應激反應，嚴重影響細胞及機體代謝，即內質網應激可能作為治療燒燙傷的重要靶點[7]。本研究結果顯示：與A、B組比較，D組PERK、P-eIF2α、CHOP、Bax、Caspase-12、Cleaved Caspase-3蛋白表達程度顯著降低，Bax/Bcl-2下降(P<0.05)。這提示，大蒜素治療燙傷創面的機制可能是抑制內質網應激相關PERK/P-eIF2α/CHOP通路。

綜上所述，大蒜素可減輕SD大鼠深Ⅱ度燙傷炎癥反應，縮短創面愈合時間，其機制可能與大蒜素抑制內質網應激相關PERK/P-eIF2α/CHOP通路有關。