誘導(dǎo)性低溫對失血性休克大鼠再灌注后腸屏障功能影響

王小磊， 柳云恩， 單永琪， 李 達(dá)， 高廣榮， 石三保， 張 婕， 張 成

1.錦州醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 研究生培養(yǎng)基地，遼寧 沈陽110016；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 普外科，遼寧 沈陽 110016

失血性休克(hemorrhagic shock，HS)為嚴(yán)重威脅人類生命的主要原因之一[1]，由于HS狀態(tài)下血液的重新分配，腸道可能會(huì)出現(xiàn)缺血缺氧狀態(tài)，使腸黏膜屏障功能發(fā)生障礙，大量腸源性損傷性因子發(fā)生移位，最終導(dǎo)致HS患者發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)與多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)等嚴(yán)重并發(fā)癥[2-4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，HS發(fā)生時(shí)自發(fā)性低體溫的出現(xiàn)標(biāo)志著更為嚴(yán)重的預(yù)后[5-7]。然而，有計(jì)劃的誘導(dǎo)性低溫(inducible hypothermia，IH)已證實(shí)是改善HS患者近遠(yuǎn)期預(yù)后及降低病死率的一種重要治療手段[8-10]。IH可在HS發(fā)生時(shí)降低機(jī)體對能量的需求，減緩新陳代謝，使機(jī)體進(jìn)入類似“假死”狀態(tài)，從而保護(hù)細(xì)胞器官免受缺血再灌注損傷，改善HS預(yù)后。本研究旨在通過建立HS大鼠動(dòng)物模型，探討IH對HS再灌注后腸屏障功能的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 高速冷凍離心機(jī)(沈陽醫(yī)療器械有限公司)；BL-420E多導(dǎo)生理記錄儀(成都金鳳有限公司)；光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS)；酶標(biāo)儀(美國 Bio-Rad公司)；組織勻漿機(jī)(上海季諾科貿(mào)有限公司)；紅外線燈(安宏達(dá)光電科技)；動(dòng)物肛溫計(jì)(北京冀諾泰科技發(fā)展有限公司)；大鼠手術(shù)器械 1 套(沈陽醫(yī)療器械有限公司)；10%的水合氯醛(上海穎心實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)；肝素鈉注射液(南京新百藥業(yè)有限公司)；0.9%氯化鈉溶液(華仁藥業(yè)股份有限公司)；酶聯(lián)免疫吸附劑測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；標(biāo)記葡聚糖(上海懋康科技有限公司)

1.2 大鼠HS模型的建立 Wistar大鼠，體質(zhì)量180～200 g，以10%的水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉成功后，于右側(cè)股動(dòng)脈及左側(cè)頸總動(dòng)脈插管(PE-50)分別用于放血和監(jiān)測平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)，右側(cè)頸靜脈插管用于液體復(fù)蘇時(shí)回輸液體。進(jìn)行氣管插管和小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，潮氣量為7～8 ml/kg，呼吸頻率為60次/min，吸入氧濃度為40%。放血量按20 ml/kg體質(zhì)量計(jì)算，放血速度為0.5 ml/min，放血時(shí)間在10 min內(nèi)完成，直至MAP達(dá)到50 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)左右。維持時(shí)間為90 min，期間可通過股動(dòng)脈放血或回輸血維持MAP穩(wěn)定。90 min后，回輸放出的血和3倍放血量的林格氏液，并監(jiān)護(hù)6 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及方法 將32只大鼠隨機(jī)分為常溫復(fù)蘇組與低溫復(fù)蘇組，每組各16只。常溫復(fù)蘇組手術(shù)插管后放血，復(fù)蘇期間通過加熱設(shè)備保持直腸溫度為38℃；低溫復(fù)蘇組手術(shù)插管后放血，復(fù)蘇期間通過酒精浴及吹風(fēng)控制直腸溫度為32℃。復(fù)蘇期維持60 min，完成后各組于3 h分別處死8只大鼠，剩余大鼠用于72 h生存分析。采集血液、腸系膜淋巴結(jié)及小腸組織標(biāo)本待檢測。

1.4 末段回腸段通透性檢測 通過檢測血漿異硫氰酸熒光素標(biāo)記葡聚糖(FITC-dextran 4KD FITC，F(xiàn)D4)濃度來評估腸道通透性[11]。大鼠復(fù)蘇完成后，腹部消毒備皮。取腹部正中切口，充分顯露小腸組織。將腸組織翻出置于生理鹽水浸泡過紗布上，選取末段回腸約4 cm腸管，5-0手術(shù)縫合線結(jié)扎腸段遠(yuǎn)近端。避光環(huán)境中，無菌1 ml注射器吸取50 μl FD4溶液，注入結(jié)扎腸段中后，緩慢將腸組織放入腹腔，縫合腹部切口。3 h后，打開腹腔，門靜脈取血。門靜脈血以3 000 r/min的速度離心10 min，吸取上清入600 μl入離心管中，用于檢測血漿FD4濃度,進(jìn)而反映腸道通透性變化。

1.5 血清炎癥細(xì)胞因子的檢測 采用大鼠酶聯(lián)免疫吸附劑測定試劑盒(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-8和IL-10濃度。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣、加樣、溫育、配液、洗滌、顯色、測定，計(jì)算出各組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10表達(dá)水平。

1.6 細(xì)菌移位的測定 將腸系膜淋巴結(jié)稱重，并置于含有0.5 ml冰冷磷酸緩沖鹽溶液的研磨管中，用研磨機(jī)研磨成勻漿，將每份250 μl的勻漿涂在培養(yǎng)基上。于37℃有氧培養(yǎng)，24 h后檢查平板。

1.7 小腸組織病理學(xué)變化 取大鼠距離回盲部10 cm的末段回腸組織，甲醛溶液固定，常規(guī)脫水石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅染色后，光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。采用Chiu氏6級評分法[12]評估小腸組織損傷程度。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠小腸壁通透性比較 低溫復(fù)蘇組大鼠小腸血漿中FD4濃度為(0.91±0.12)μg/ml，明顯低于常溫復(fù)蘇組的(1.25±0.12)μg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大鼠在HS后小腸壁通透性增大，使標(biāo)記葡聚糖大量進(jìn)入血液中，而誘導(dǎo)性低溫療法能夠明顯降低大鼠小腸壁的通透性。

2.2 兩組大鼠血清炎癥因子含量比較 采用ELISA法對大鼠血清炎癥相關(guān)因子進(jìn)行檢測，低溫復(fù)蘇組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8均明顯低于常溫復(fù)蘇組，IL-10明顯高于常溫復(fù)蘇組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組大鼠血清炎癥因子含量比較

2.3 兩組大鼠腸系膜淋巴結(jié)的細(xì)菌含量比較 低溫復(fù)蘇組大鼠腸系膜淋巴結(jié)平均細(xì)菌移位量為(21.34±0.91)CFU/g，明顯低于常溫復(fù)蘇組的(45.25±0.54)CFU/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 兩組大鼠腸黏膜病理變化 常溫復(fù)蘇組光鏡 下病理改變：小腸黏膜層水腫明顯，上皮層和固有層間隙部分分離，重度炎細(xì)胞浸潤，小腸絨毛萎縮，排列紊亂。低溫復(fù)蘇組光鏡下病理改變：小腸黏膜組織較完整，排列整齊，上皮層下間隙輕度水腫，少量炎細(xì)胞浸潤，小腸絨毛排列整齊。見圖2。常溫復(fù)蘇組大鼠的小腸黏膜損傷程度評分為(3.25±0.71)分，顯著高于低溫復(fù)蘇組的(2.13±0.84)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 兩組大鼠腸黏膜病理變化(a.常溫復(fù)蘇組；b.低溫復(fù)蘇組；HE×200)

2.5 兩組大鼠生存情況比較 兩組大鼠在休克期及復(fù)蘇期均無死亡。常溫復(fù)蘇組4只大鼠分別于250、310、410、500 min死亡，低溫復(fù)蘇組大鼠全部存活。Kaplan-Meier生存分析顯示，常溫復(fù)蘇組、低溫復(fù)蘇組組間比較，存活率分別為50.0%(4/8)、100.0%(8/8)，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

HS作為創(chuàng)傷及外科手術(shù)后的常見并發(fā)癥，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類生命健康的重要原因[1]。盡管通過損傷控制性手術(shù)控制出血后輔以合理的液體復(fù)蘇策略可有效改善大部分患者的臨床預(yù)后，但仍有部分患者腸黏膜上皮細(xì)胞因無氧代謝和酸中毒而受損，導(dǎo)致正常腸黏膜屏障功能遭受破壞，腸腔內(nèi)大量的細(xì)菌與內(nèi)毒素通過淋巴或血循環(huán)移位至其他組織器官，最終引起SIRS甚至MODS等嚴(yán)重并發(fā)癥,導(dǎo)致治療失敗[2-3,13]。因此，腸黏膜屏障功能的損害程度與HS患者的預(yù)后密不可分。

IH可以改善能量代謝失衡，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)組織免于缺血再灌注損傷，同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體耐受性，延長救治的“黃金時(shí)間”，從而改善HS的預(yù)后[8-10]。Shi等[14]通過制作大鼠HS模型，研究低溫治療對大鼠的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HS的情況下給予IH治療可以提高長期存活率，并減弱了HS后的炎癥反應(yīng)。分析其原因，IH可以通過降低氧需求，保存組織ATP水平，降低代謝率，并減少缺血再灌注后活性氧自由基的產(chǎn)生，進(jìn)而保護(hù)器官免受缺血性損傷，提高細(xì)胞功能和存活率。有研究發(fā)現(xiàn)，對HS大鼠進(jìn)行IH治療后減少了大鼠腸系膜循環(huán)中白細(xì)胞的粘附和肥大細(xì)胞的脫粒，減輕了炎癥反應(yīng)程度，改善了HS大鼠的預(yù)后[15]。

在HS的情況下，低溫的潛在有害影響仍存在爭議，其可能影響血小板和凝血因子功能，導(dǎo)致凝血機(jī)制障礙；影響心肌收縮性和血管反應(yīng)性，導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)崩潰；影響白細(xì)胞游走能力及免疫反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降等[5-7，16]。腸道是HS及缺血-再灌注損傷時(shí)最易受累的器官，也是應(yīng)激反應(yīng)的中心[17-20]。細(xì)菌移位是導(dǎo)致HS患者不良預(yù)后的關(guān)鍵。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與常溫復(fù)蘇組比較，低溫復(fù)蘇組大鼠血漿中FD4濃度及腸系膜淋巴結(jié)中的細(xì)菌移位量顯著降低。這提示，IH能夠降低HS大鼠小腸壁的通透性。本研究結(jié)果還顯示，與常溫復(fù)蘇組比較，低溫復(fù)蘇組大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β等表達(dá)水平均明顯降低，且抑炎因子IL-10的表達(dá)水平明顯增高。這些數(shù)據(jù)提示，IH可以有效減輕HS大鼠炎癥反應(yīng)程度，且這一趨勢與腸黏膜病理損傷程度相吻合，更進(jìn)一步證實(shí)IH能夠顯著降低腸黏膜損傷程度，進(jìn)而減輕腸屏障功能障礙，抑制腸道內(nèi)腸源性損傷因子易位，減輕全身炎癥反應(yīng)。此外，對大鼠的72 h生存分析結(jié)果也提示，IH可能是提高存活率、改善預(yù)后的重要治療策略。

綜上所述，誘導(dǎo)性低溫復(fù)蘇可有效抑制大鼠失血性休克后炎癥反應(yīng)，改善腸屏障功能和黏膜組織損傷，從而提高存活率。這可能為HS后SIRS和MODS的防治提供新的思路，但如何確定IH的最佳維持時(shí)間和復(fù)溫時(shí)機(jī)并廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐中仍需更多大規(guī)模研究進(jìn)一步證實(shí)。