凍-放射復合傷中大鼠肺損傷情況及其機制研究

徐 瑩， 任 雪， 姜 曈， 呂東陽， 高寬科， 王海旭， 閻 英

北部戰區總醫院 放療科，遼寧 沈陽 110016

寒冷是一種復雜、特殊的環境，長期暴露于寒冷環境可致機體多器官功能紊亂。持續暴露于低溫環境時，核心體溫降低常引起全身凍傷(凍僵)，對心腦血管系統、呼吸系統、泌尿系統、免疫系統以及骨關節運動系統等產生嚴重損害，甚至威脅生命。寒冷環境下遭受輻射可形成“凍-放射復合傷”。目前，國內外尚缺乏“凍-放射復合傷”相關的機制及救治方案研究，亟需建立動物模型進行基礎理論探索。本研究通過模擬寒區輻射現場，建立“凍-放射復合傷”動物模型，觀察復合傷中肺損傷情況，旨在探討肺損傷的致傷機制，為制定“凍-放射復合傷”應急預案和救治流程提供理論依據?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 40只6～8周齡雄性SD大鼠購自本溪長生生物科技有限公司。所用放射治療設備為SIEMENS直線加速器。白細胞介素1(interleukin-1，IL-1)、轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)酶聯免疫吸附試劑盒購自酶科生物公司，BCA蛋白檢測試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，MDA5、SOD-25).、Cytochrome C、Bax、Bcl-2抗體以及Ahsg/RAGE/NF-κB信號通路相關抗體購自英國Abcam公司。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗分組及模型建立 將40只雄性大鼠隨機分成對照組、寒冷組、放射組和凍-放射組，每組各10只。將大鼠每天置于人工氣候箱內6 h，箱內溫度調至-10℃，6 h后置于22℃～24℃的室溫環境，共持續7 d，第8天接受20 Gy X射線全身單次照射(6 MV-X線，劑量率為220 cGy/min，SSD 100 cm)。

1.2.2 一般癥狀觀察 觀察大鼠一般狀態、營養、皮毛光澤度、活動能力、飲食、體質量、呼吸、排泄物性狀 。

1.2.3 組織學觀察 照射后72 h處死所有大鼠進行實驗標本采集，收集肺組織標本，置于10%中性甲醛溶液中充分固定，然后取材、包埋、切片、HE染色，最后于光學顯微鏡下攝片觀察肺組織形態學改變。

1.2.4 血液分析檢測 于照射后72 h采集血標本，送至本溪長生生物科技有限公司進行血液分析化驗，檢測白細胞、淋巴細胞、血小板、血紅蛋白水平。

1.2.5 血氣分析 照射72 h后采集腹主動脈血進行血氣分析檢測，測量動脈pH值、二氧化碳分壓(partial pressure of carbon dioxide，PaCO2)及動脈氧分壓(arterial partial pressure of oxygen ，PaO2)。

1.2.6 酶聯免疫吸附法 采血3 000 g離心10 min，收集上清并凍存在-80℃冰箱中備用。采用酶聯免疫吸附試劑盒檢測大鼠血清中IL-1、TGF-β的表達水平。

1.2.7 肺濕重/干重比值 用濾紙干燥右肺上葉，用天平測量肺濕重。右肺上葉隨后在60℃的烘箱中干燥72 h，記錄干重。計算濕重/干重比值提示水腫形成情況。

1.2.8 蛋白免疫印跡法 采用蛋白提取試劑盒提取大鼠肺標本蛋白，應用BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度，檢測凋亡相關因子Cytochrome C、Bax 和Bcl-2的表達；檢測氧化應激相關蛋白MDA5和SOD-2的表達，同時檢測Ahsg/RAGE/NF-κB信號通路蛋白表達。

2 結果

2.1 各組大鼠的一般狀態觀察結果比較 對照組大鼠狀態良好，毛發光澤，體質量逐漸增加，呼吸平穩，便質正常。寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠一般狀態較差，拱背蜷縮，扎堆，呼吸急促，進食差，體質量減輕。放射組和凍-放射組大鼠出現腹瀉、脫毛、鼻黏膜出血等癥狀。與對照組比較，放射組、凍-放射組大鼠體質量明顯降低，且凍-放射組低于放射組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠體質量變化情況

2.2 各組大鼠血液分析結果比較 與對照組比較，寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠白細胞、淋巴細胞均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，放射組和凍-放射組大鼠血紅蛋白明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 大鼠血象變化情況(a.各組大鼠白細胞水平；b.各組大鼠淋巴細胞水平；c.各組大鼠血紅蛋白水平；d.各組大鼠血小板水平)

2.3 各組大鼠血氣分析結果比較 與對照組比較，放射組、凍-放射組大鼠的pH值明顯降低，PaCO2明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血氣分析結果

2.4 各組大鼠炎性因子表達水平比較 寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠血清中IL-1、TGF-β表達水平顯著高于對照組，且凍-放射組高于寒冷組和放射組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠炎性因子表達水平比較(a.各組大鼠IL-1表達水平；b.各組大鼠TGF-β表達水平)

2.5 各組大鼠肺水腫情況比較 與對照組比較，寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠肺重量/體質量比值和濕重/干重比值均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠肺水腫情況比較(a.各組大鼠肺重量/體質量比值；b.各組大鼠濕重/干重比值)

2.6 各組大鼠肺損傷情況比較 組織病理學分析顯示，寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠均出現了肺損傷改變，其特征是肺體積增大，有明顯的出血、水腫、炎性細胞浸潤，其中，凍-放射組織肺組織損傷最為明顯。見圖5。

圖5 各組大鼠肺損傷情況比較(a.對照組；b.寒冷組；c.放射組；d.凍-放射組)

2.7 各組大鼠MDA5、SOD-2表達情況比較 與對照組比較，寒冷組、放射組、凍放射組MDA5表達升高，SOD-2的表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與寒冷組比較，放射組、凍-放射組MDA5表達升高，SOD-2表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組大鼠MDA5、SOD-2表達情況比較

2.8 各組大鼠肺組織凋亡相關因子水平比較 與對照組比較，寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠肺組織Cytochrome C、Bax表達增加，Bcl-2表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與寒冷組比較，放射組和凍-放射組大鼠肺組織Cytochrome C、Bax表達增加，Bcl-2的表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖7。

圖7 各組大鼠肺組織凋亡相關因子水平比較

2.9 各組大鼠Ahsg/RAGE/NF-κB信號通路蛋白表達情況比較 與對照組比較，寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠肺組織的Ahsg、RAGE、NF-κB蛋白表達顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。與寒冷組和放射組比較，凍-放射組大鼠肺組織的Ahsg/RAGE/NF-κB蛋白表達顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖8。

圖8 各組大鼠Ahsg、RAGE、NF-κB信號通路蛋白表達情況比較

3 討論

我國北部地區多地域均處于寒區，在寒冷環境下遭受核輻射可形成“凍-放射復合傷”，研究凍-放射復合傷對特殊條件下衛生保障具有重要的現實意義。本研究發現，經放射的大鼠一般狀態較差，出現拱背蜷縮、扎堆、進食差、體質量減輕、腹瀉、脫毛、鼻黏膜出血等癥狀，全血中白細胞、淋巴細胞明顯降低，血清中IL-1和TGF-β明顯升高。有研究表明，寒冷應激或輻射暴露可導致如IL-1、白細胞介素、腫瘤壞死因子α、TGF-β等炎癥介質釋放[1-3]。

肺是對寒冷應激反應十分明顯的器官，主要表現為不能自主的過渡通氣，肺通氣量提高8倍，但肺內氧彌散量和氧合效果均明顯下降[4]。同時，肺也是對放射線最敏感的器官之一，一旦輻射劑量超過輻射閾值，放射性損傷超出肺組織固有的修復能力時，便發生肺損傷。本研究通過組織病理學檢查發現，寒冷組、放射組、凍-放射組大鼠肺部主要病理變化表現為以中性粒細胞聚集的肺部炎性反應，肺泡-毛細血管膜通透性增加導致肺組織水腫，肺泡內透明膜形成，以及由于血管內皮受損導致的血栓形成和出血。本研究中，凍-放射組肺泡間隔水腫明顯，可見大量中性粒細胞浸潤，部分可見肺泡間隔出血等病理變化。為了解這些病理改變對大鼠肺氣血交換功能的影響，本研究在造模后72 h抽取大鼠動脈血進行血氣分析，結果發現，寒冷組pH值、PaO2、PaCO2與對照組比較無明顯差異，原因可能為本研究大鼠于第1～7天置于寒冷環境，然后在常溫環境中繼續飼養4 d后處死，可能此時大鼠的呼吸功能有所恢復。與對照組比較，放射組和凍-放射組大鼠的pH值明顯降低，PaCO2明顯增高，而PaO2有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，提示放射組、凍-放射組大鼠肺部損傷較重，最終導致了血氧交換功能受損傷。

目前，尚不清楚凍-放射復合傷的機制。氧化應激被認為是肺損傷發病機制中的關鍵因素[5-9]。有研究表明，在實驗動物模型中，通過清除中性粒細胞、補體或聯合超氧化物歧化酶和過氧化氫酶進行全身治療，可以預防急性肺損傷[10-11]。SOD-2表達對急性肺損傷有保護作用。本研究發現，與對照組、寒冷組相比，輻射暴露顯著增加了大鼠肺組織氧化應激因子MDA5的表達增加，表明放射組和凍-放射組大鼠肺組織中存在高水平的氧化應激，而利于清除氧化應激調節的SOD-2的表達降低[12]。有研究發現，上調Sirt3水平可促進SOD-2、Nrf2、GST-Pi和GPX-1蛋白表達，抑制MDA、GSH、iNOS的水平，從而增強抗氧化能力，提示通過調節Sirt3信號可減輕氧化損傷，對抗糖尿病肺纖維化肺損傷[13]。因本研究觀察時間較短，肺組織尚未出現纖維化的病理學改變，但SOD表達下降可能會促進后續肺纖維化進程，相關調節通路有待進一步研究。

細胞凋亡是肺損傷的另一重要機制。凋亡主要由兩條不同的信號通路啟動，一種是外源性(死亡受體依賴)途徑，另一種是內源性(線粒體依賴)途徑[14]。當細胞表面死亡受體(如Fas)與其配體結合時，外源性途徑被觸發。Te內在途徑是由線粒體外膜的完整性喪失介導的，這導致線粒體蛋白(如細胞色素c)從線粒體釋放到細胞質中。線粒體途徑由Bcl2蛋白家族控制，其可以促凋亡(如Bid、Bim、Bad、Noxa)或抗凋亡(如Bcl2、Bcl-xL、Mcl1)。本研究發現，與對照組相比，寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠肺組織的凋亡相關因子Cytochrome C、Bax的表達增加，Bcl-2的表達下降；與寒冷組相比，放射組和凍-放射組大鼠肺組織的凋亡相關因子Cytochrome C、Bax的表達增加，Bcl-2的表達下降，提示放射組和凍-放射組大鼠肺部組織凋亡明顯，損傷更重，其調控可能是通過線粒體途徑進行。

進一步研究發現，寒冷組、放射組和凍-放射組大鼠肺組織的Ahsg、RAGE、NF-κB蛋白表達顯著增加；與對寒冷組和放射組相比，凍-放射組大鼠肺組織的Ahsg、RAGE、NF-κB蛋白表達顯著增加。Ahsg是一種主要由成人肝分泌的糖蛋白，具有促炎和抗炎作用[15]。體外研究表明，AHSG刺激單核細胞遷移和促炎細胞因子的產生。此外，Ahsg作為一種抗炎介質，參與巨噬細胞失活、抗纖維化活性、氧化應激和抑制凋亡[16]。Ahsg還可能是一種內源性配體，在通過TLR4信號調節小鼠胰島素敏感性方面起著關鍵作用[17]。此外，高表達RAGE可激活NF-κB，上調多種炎癥細胞因子，導致炎癥反應和氧化應激反應[18-19]。

綜上所述，本研究通過建立凍-放射復合傷模型，觀察到大鼠肺部損傷情況，其損傷機制可能通過Ahsg/RAGE/NF-κB信號通路實現。