宮頸癌中Hippo-Yes相關蛋白1、雷帕霉素靶蛋白的表達及臨床意義

郭歷琛，楊 歡，石 琴，張 銳

(上海健康醫學院附屬嘉定區中心醫院婦產科，上海 201800)

宮頸癌是女性生殖系統常見惡性腫瘤，發病率位居女性惡性腫瘤前三，全球每年新發病例超50萬，發展中國家病例約占4/5[1]。隨宮頸癌篩查普及率的上升，宮頸癌檢出率上升，死亡率下降，但有明顯年輕化趨勢[2]。現今仍未完全闡明宮頸癌發病機理，多認為與多次孕產史、性生活紊亂及人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染密切相關[3，4]。近年來也有證據顯示，宮頸癌發病累及多基因、多步驟，與原癌基因激活、抑癌基因喪失及突變存在緊密聯系[5]。Hippo-Yes相關蛋白1(Hippo-Yes associated protein 1，YAP1)由YAP1基因編碼，屬富脯氨酸磷蛋白，為Hippo信號通路下游轉錄共激活因子，其表達異常或基因突變對細胞增殖、凋亡基因調節產生影響，導致Hippo-YAP通路調節異常，引起靶基因轉錄活性上升，誘導腫瘤形成。已發現YAP1與卵巢癌發生及進展有關[6]。YAP1參與多種信號轉導通路，可維持細胞的增殖以及凋亡之間的平衡，在胰腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發生發展中起到重要作用。雷帕霉素靶蛋白(mammalian target protein of rapamycin，mTOR)為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為磷酸肌醇3/蛋白激酶B信號通路調節因子，承擔多種蛋白轉錄、翻譯功能，與細胞生長、凋亡、自噬密切相關[7]。mTOR信號通路能夠調節和腫瘤發生有關的細胞增殖、細胞周期等多種細胞功能，其失調和腫瘤形成具有緊密關聯性。前期報道發現，mTOR信號異常活化與乳腺癌發生有關，并影響其預后[8]。對于YAP1、mTOR蛋白能否在宮頸癌中的起到調節和平衡作用目前還未完全清楚。為探究YAP1、mTOR與宮頸癌病理特點的關系，本文對收治的92例宮頸癌、50例宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及50例子宮肌瘤女性宮頸組織YAP1、mTOR蛋白表達進行檢測，探討YAP1、mTOR在宮頸癌組織中的表達及意義，以期為宮頸癌防治提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年1月至2020年1月我院收治的宮頸癌患者92例作為宮頸癌組，獲取手術切除癌組織標本92份。同期收治的50例CIN患者作為CIN組，獲取宮頸組織病理切片50份。同期因子宮肌瘤接受手術治療但宮頸功能正常的50例患者作為對照組，獲取宮頸組織病理切片50份。入選標準：宮頸癌組均經手術病理確診為宮頸癌；CIN組均行宮頸錐切術，病理切片證實為CIN；對照組均行全子宮切除均病理證實宮頸組織正常；年齡均超過22歲；病歷資料完善，有完整隨訪資料。排除標準：合并其他惡性腫瘤；宮頸癌復發；嚴重心肝腎肺功能不全；嚴重腦血管疾病；精神疾病；孕期或哺乳期女性；所獲取標本不滿意；臨床資料不全。宮頸癌組年齡29～74歲[(49.51±10.76)歲]；分期：Ⅰ期31例，Ⅱ期41例，Ⅲ期20例；病理類型：鱗癌75例，腺癌17例；病理分化程度：低分化20例，中分化45例，高分化27例；神經脈管侵犯54例，宮旁侵犯52例，淋巴結轉移48例。CIN組年齡27～72歲[(47.96±11.52)歲]。對照組年齡26～70歲[(48.11±10.79)歲]。

1.2 方法

1.2.1主要試劑與儀器 兔抗人mTOR單克隆抗體(抗體稀釋濃度1：100)、鼠抗人YAP1單克隆抗體(抗體稀釋濃度1∶400)均購自美國Abcam公司，即用型S-P試劑盒(過氧化物酶阻斷劑、生物素標記二抗、鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶)購自瑞士羅氏公司，二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，蘇木素、二甲苯均購自美國Invitrogen公司；Axio Imager M2 m全自動顯微鏡購自德國蔡司公司。

1.2.2免疫組化染色法測定組織YAP1、mTOR蛋白表達 采用免疫組化染色法測定宮頸組織YAP1、mTOR蛋白表達，具體如下：三組宮頸組織石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，熱抗原修復，3%過氧化氫孵育10 min，分別加入鼠抗人YAP1單克隆抗體(1∶400稀釋)、兔抗人mTOR單克隆抗體(1∶100稀釋)，4 ℃恒溫過夜，滴加過氧化物酶標記二抗(1∶2000稀釋)，孵育60 min，加入DAB顯色劑顯色，蘇木素復染1 min，梯度乙醇分化30 s，氨水返藍1 min，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，磷酸鹽緩沖液作為陰性對照。

1.3 結果判定[9]每切片隨機取5個高倍視野觀察YAP1、mTOR陽性染色情況。YAP1陽性產物定位于細胞漿與細胞核，呈淡黃色、棕黃色、棕褐色染色；mTOR陽性產物定位于細胞質與細胞核，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色染色。依據陽性染色數目及染色程度評估陽性情況。陽性數目占比：0分(無陽性細胞著色)，1分(陽性細胞數目占10%)，2分(陽性細胞數目占11%～50%)，3分(陽性細胞數目占51%～80%)，4分(陽性細胞數目超過80%)；染色強度：0分(無著色)，1分(淡黃色)，2分(棕黃色)，3分(棕褐色)。最終評分結果為陽性染色占比與染色程度評分乘積，陽性：乘積>4分。

1.4 統計學方法數據處理采用SPSS 20.0統計學軟件。計量資料以均數±標準差表示，多組計量數據對比進行單因素方差分析，組間獨立樣本t檢驗；計數資料用[(n)%]表示，χ2檢驗或Fisher確切概率分析，采用Spearman相關分析法分析宮頸癌癌組織YAP1與mTOR表達的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組宮頸組織YAP1、mTOR蛋白表達陽性率比較CIN組、宮頸癌組宮頸組織YAP1、mTOR蛋白表達陽性率高于對照組(P<0.05)，宮頸癌組YAP1、mTOR蛋白表達陽性率又高于CIN組(P<0.05)，見表1與圖1～圖2。宮頸癌組宮頸組織YAP1蛋白表達于細胞質、細胞核，mTOR陽性產物多表達于細胞質，呈棕褐色、棕黃色染色，著色程度高，陽性染色細胞比例高；CIN組宮頸組織YAP1、mTOR陽性產物多呈淺著色，陽性染色細胞比例少；對照組宮頸組織YAP1、mTOR蛋白著色程度低，陽性染色細胞比例極少。

圖1 三組宮頸組織YAP1蛋白表達情況(HE×200) a：對照組；b：CIN組；c：宮頸癌組

2.2 不同病理特點宮頸癌患者宮頸組織YAP1、mTOR蛋白表達陽性率不同年齡、病理類型宮頸癌患者宮頸組織YAP1、mTOR蛋白表達陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)，臨床分期為Ⅲ期、分化程度為低分化、伴宮旁侵犯、脈管侵犯及淋巴結轉移的宮頸癌患者宮頸組織YAP1、mTOR蛋白表達陽性率高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、病理分化程度為中高分化、不伴宮旁侵犯、不伴脈管侵犯及無淋巴結轉移的宮頸癌患者(P<0.05)，宮頸浸潤深度>1/3的宮頸癌患者mTOR陽性率高于宮頸浸潤深度≤1/3的宮頸癌患者(P<0.05)，見表2。

表2 不同病理特點宮頸癌患者宮頸組織YAP1、mTOR蛋白表達陽性率比較 [n(%)]

2.3 宮頸癌癌組織YAP1與mTOR表達相關性分析92例宮頸癌患者mTOR陽性79例中YAP1陽性65例，13例mTOR陰性患者中YAP1陰性9例；Spearman相關分析顯示，宮頸癌癌組織YAP1、mTOR表達呈正相關(r=0.489，P<0.05)，見表3。

表3 宮頸癌癌組織YAP1與mTOR表達相關性分析

3 討論

YAP1蛋白為近年來發現Hippo信號通路下游關鍵轉錄共激活蛋白，承擔促組織再生、維持干細胞自我更新、修復等生物學功能。最新研究發現，YAP1參與細胞增殖、凋亡調節及腫瘤形成過程，在較多惡性腫瘤均呈高表達，且能促進癌細胞增殖、分化及侵襲[10]。本研究發現，宮頸癌患者癌組織YAP1蛋白表達陽性率高于CIN與對照組，隨宮頸病變的進展，YAPI陽性率上升，與前期研究結論存在共性，推測YAP1可能為一類致癌基因，參與宮頸癌發生及進展過程。考慮YAP1為Hippo通路中心信號分子，YAP1過表達時，該通路下游靶信號激活，YAP1發生去磷酸化反應，活性增加，細胞核內轉移及聚集，與轉錄因子結合促進結締組織生長因子等下游靶基因增殖，誘導癌細胞相關基因異常表達，抑制凋亡基因過表達，發揮促增殖及凋亡抵抗作用，打破細胞增殖、凋亡調控平衡，導致癌細胞過度增殖，誘導宮頸癌發生及進展。國外有報道指出，YAP1細胞核內蓄積與卵巢癌惡性生物學行為有關[11]。本研究發現，YAP1蛋白高表達宮頸癌患者病變程度更高，分化更差，更易出現脈管侵犯、宮旁侵犯、淋巴結轉移，得出與上述卵巢癌中相似結論，說明YAP1蛋白可能與宮頸癌惡性程度有關。推測YAP1高表達可能直接影響宮頸癌癌細胞增殖、分化，提高癌細胞侵襲性，導致癌細胞向惡性表型轉化。但本研究尚未顯示不同宮頸浸潤深度宮頸癌患者YAP1陽性表達差異，與Serrao等[12]結論存在區別，分析可能與本研究樣本數量少、病例納入標準不同有關，后續需進一步擴充樣本量論證該結論。

mTOR為絲/蘇氨酸下游基因，可通過調節細胞增殖、遷移及影響放化療耐藥等途徑參與多種腫瘤發生與進展過程。有研究指出，mTOR可通過與Rho A/Rac 1酶作用促進細胞重塑與上皮間質轉化，促進結腸癌侵襲及進展[13]。Webb等[14]發現，mTOR活化后可調控真核細胞翻譯起始因子結合蛋白磷酸化反應，參與蛋白質轉錄、翻譯過程，調控細胞增殖、分化。但宮頸癌中mTOR的作用目前尚未完全闡明。本研究結果顯示，宮頸癌患者癌組織mTOR表達陽性率高于CIN與對照組，且在宮頸病變早期mTOR即存在，隨宮頸病變的發展而表達增多；且病理分化程度越差、臨床分期越高、宮頸浸潤深度高，且伴宮旁侵犯、脈管侵犯、淋巴結轉移的宮頸癌患者mTOR陽性率更高，支持Bahrami等[15]研究結論，證實mTOR高表達可能促成宮頸癌發病及進展。推測mTOR活化可促使宮頸上皮細胞致癌因子活化，導致宮頸上皮細胞異常增殖，影響自身凋亡機制，介導增殖、凋亡失衡，導致癌細胞異常增殖，誘導宮頸癌發生。有研究表明，YAP1通路能夠對mTOR信號通路起到激活作用，使細胞生長重組，在腫瘤的發證以及發展中發揮重要作用[16]。本研究還發現，宮頸癌患者癌組織YAP1、mTOR蛋白表達互相呈正相關，推測兩者可能協同參與宮頸癌細胞增殖、凋亡失衡調節過程，考慮兩者均可通過促癌細胞增殖、抑制癌細胞凋亡的途徑誘導宮頸癌發病及進展，或可能存在相似的機制，有待進一步展開體內外研究證實。

綜上，宮頸癌患者癌組織YAP1、mTOR蛋白表達陽性率高于CIN與正常宮頸組織，兩者均與宮頸癌發生及進展有關，隨宮頸癌分期的上升、分化程度的變差、腫瘤侵犯范圍的增加，YAP1、mTOR陽性率增加，兩者可能協同參與宮頸癌發生及進展過程，可能為宮頸癌防治的新靶點。由于觀察時間尚短，本研究尚未明確YAP1、mTOR蛋白表達對宮頸癌近遠期預后的影響，有待跟蹤隨訪后充實本結論，作為下一步研究的新方向。