鈍頂螺旋藻分離純化SOD的中試生產

謝婷玉,張亞旗,盧珍華,蘇國成,張鈴玉

(集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021)

0 引言

螺旋藻起源于非洲和拉丁美洲[1]，在地球上存在的時間超過35億a，被稱為自然界的活化石。螺旋藻中蛋白質含量豐富[2-3]，是目前已知的理想蛋白質來源[4]，螺旋藻的早期研究也集中于此。近年來，研究發現，螺旋藻內含有的酶具有抗氧化、抗炎以及抗腫瘤等多種生物活性[5-6]，從螺旋藻中獲得生物酶的工藝研究受到越來越廣泛的關注[7]。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一種重要的抗氧化劑，它廣泛存在于自然界的動物、植物以及一些微生物體內[8-9]。SOD按其所含金屬輔基的不同可分為Mn、Fe、Cu/Zn、Ni 4種類型[10-11]。SOD可有效清除體內的自由基，在抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、抗炎癥和抗衰老等方面發揮著重要作用，被廣泛地應用于醫藥、食品及化妝品行業[12-13]。在醫藥行業，SOD可用來治療多種由超氧陰離子自由基引發的疾病，比如類風濕關節炎[14]、高血壓[15]等。在食品行業，SOD可作為果汁、啤酒和罐頭等食品的抗氧化劑，便于食品的保鮮、保藏[16]。在化妝品行業，SOD是防曬霜、面霜、眼霜等產品中重要的添加劑之一，在防曬、抗衰、祛斑等方面有明顯的功效[17]。此外，Carillon等[18]的實驗結果表明，富含SOD的濃縮甜瓜汁可有效預防高血壓的發生與發展。

目前，SOD的來源主要有動物、微生物和植物3種。動物來源方面，比如羊血[19]是目前SOD的主要來源，但是由于動物原料價格相對昂貴且易受污染，亟需尋找工業化生產SOD的替代方式[20-21]。微生物來源方面，比如類球紅細菌[22]，該來源安全性欠佳且提取技術尚不成熟。植物來源方面，比如番茄[23]、玉米[24]等，該來源因具有安全可靠、原料廣泛、適合大批量生產的特點，已成為最有潛力的生產方式，但目前尚停留在實驗室階段，有待進一步研究。為了建立一種從植物源中穩定獲得高比活力SOD的中試生產方法，本文在韓文清等[25]實驗室研究的基礎上，對鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)來源的SOD進行中試放大生產，為植物來源SOD產業化的實現提供一定的理論指導。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

鈍頂螺旋藻干粉，福建省神六保健食品有限公司提供。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和硫酸銨，西隴科學股份有限公司；離子交換樹脂填料，蘇州納微科技有限公司；凝膠過濾層析填料，通用電氣醫療集團；SOD檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術。

1.2 儀器與設備

不銹鋼反應釜 (100 L)，淄博蓋億化工設備有限公司；高速管式分離機，海寧市亞東過濾設備有限公司；卷式膜中試設備，三達膜科技；中空纖維膜中試設備，非標；三足離心機，江蘇賽德力制藥機械制造有限公司；高速冷凍連續流離心機，HITACHI，日本；GE ATKA Pure 蛋白純化儀，GE Healthcare，瑞典；酶標儀，賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SOD的純化工藝流程

SOD的純化工藝流程見圖1。

1)螺旋藻破壁處理。在室溫下，往反應釜中加入100 L的純化水，然后投入716 g磷酸氫二鈉、80 g磷酸二氫鈉，以60 r/min的速度攪拌5 min。當pH值穩定在7.8左右時開始投料，加入螺旋藻干粉5 kg，以相同速度攪拌5 h。

2)離心濃縮。首先，用三足離心機對處理好的料液反復離心2次；其次，用管式離心機以14 000 r/min的轉速和750 mL/min的進料速度進行離心去渣并收集上清液；再次，用中空纖維膜按照V(上清液)∶V(純化水)=1∶1的比例反復處理上清液；最后，用分子截留量為10 ku的納濾膜對SOD清液進行濃縮，得到濃縮液。按照V(濃縮液)∶V(純化水)=1∶1的比例對濃縮液進行3次重復除雜。

3)兩步鹽析萃取。第一步鹽析：粗SOD濃縮液倒入反應釜中并打開冷油。在反應釜中以10 ℃、60 r/min的轉速攪拌0.5 h，同時緩慢加入17.55 kg硫酸銨。0.5 h后將料液放出，于4 ℃下靜置2 h。用管式離心機對料液進行離心，收集上清液。第二步鹽析：在硫酸銨飽和度為40%～90%范圍內進一步鹽析。將第一步鹽析獲得的上清液再次倒入反應釜，在反應釜中以10 ℃、60 r/min的轉速攪拌0.5 h，同時緩慢加入3.105 kg硫酸銨。硫酸銨飽和度分別調至50%，60%，70%，80%，90%。0.5 h后將料液放出，于4 ℃ 下靜置2 h。用管式離心機對料液進行離心，收集沉淀，去除上清液。沉淀用1 L、pH=7.8、20 mmol/L的磷酸緩沖溶液復溶。用分子截留量為200 u的納濾膜對1 L的SOD溶液進行脫鹽，當SOD溶液的電導率為3 ms/cm時，第二步鹽析結束。

4)柱層析精制純化。采用GE AKTA Pure半制備型蛋白純化儀系統將兩步鹽析后獲得的SOD溶液進一步純化。主要填料為Uni Gel DEAE 50XS和SuperdexTM200。

DEAE離子交換色譜柱層析：將兩步鹽析獲得的SOD沉淀用pH=7.8、20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶解后，用AKTA Pure 進行Uni Gel DEAE 50XS柱層析(柱尺寸φ15 mm×310 mm，柱體積54.5 mL)。利用波長280 nm進行監測，每10 mL流份收集1管，共收集50管。測定每管的酶活力，將酶活力大于500 U/mg 的部分收集、濃縮。

SuperdexTM200凝膠過濾柱層析：將DEAE柱層析純化后的SOD濃縮液再用SuperdexTM200凝膠過濾柱層析進一步純化(柱尺寸φ10 mm×300 mm，柱體積26.4 mL)。利用波長280 nm進行監測，每0.5 ml流份收集1管，共收集50管。測定每管的酶活力，將酶活力大于4 000 U/mg的部分收集，最終得到目標產品。

5)成品干燥制備。將收集到的活力大于4 000 U/mg的SOD溶液進行冷凍干燥，制成干粉。

6)純化倍數與回收率的計算。純化倍數=對照組的比活力/實驗組的比活力，其中：對照組的比活力為粗藻液比活力(U/mg)；實驗組的比活力為每道純化工序后的比活力(U/mg)。純化順序為超濾、鹽析、DEAE柱層析、凝膠過濾柱層析?；厥章?%=(實驗組總活力/對照組總活力)×100，其中：實驗組總活力為每道純化工序后的總活力(IU)；對照組總活力為粗藻液總活力(IU)。純化順序為超濾、鹽析、DEAE柱層析、凝膠過濾柱層析。

1.3.2 SOD活力及蛋白質濃度測定

采用南京建成生物工程研究所的SOD測定試劑盒WST-1法對SOD活力進行測定；采用碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010)對SOD蛋白質濃度進行測定。SOD活力測定計算見以下公式：SOD抑制率/%=[(A1-A2)-(A3-A4)/(A1-A2)]×100， SOD活力/(U·mg-1)=(SOD抑制率÷50%×(反應體系/稀釋倍數)/待測樣本蛋白質濃度，其中：A1為對照(20 μL雙蒸水、20 μL酶工作液、200 μL底物應用液)的吸光度值；A2為對照空白(20 μL雙蒸水、20 μL酶稀釋液、200 μL底物應用液)的吸光度值；A3為測定(20 μL待測樣品、20 μL酶工作液、200 μL底物應用液)的吸光度值；A4為測定空白(20 μL待測樣品、20 μL酶稀釋液、200 μL底物應用液)的吸光度值。

1.3.3 SDS-PAGE分析

用SDS-PAGE方法[25-26]對分離提純得到的SDS進行分子質量分析。將樣品用5%的堆積凝膠在恒壓80 V的條件下分離20～30 min后，再用質量分數為12%的分離凝膠在恒壓100 V的條件下分離1.5 h。

2 結果與分析

2.1 螺旋藻SOD的提取純化

螺旋藻經超濾、分段鹽析、DEAE柱層析、凝膠過濾柱層析后，總活力、酶比活力、提純倍數、回收率結果如表1所示。由表1可見，從螺旋藻中最終獲得的SOD的比活力為4 131.00 U/mg，純化倍數達到了238.96，回收率為8.30%。這與韓文清等[25]獲得的結果(SOD比活力為2 078.20 U/mg，純化倍數為126.50，回收率為19.90)相比，酶的比活力和純化倍數均顯著提高，回收率有所降低。推測原因是本實驗對提取工藝進行了優化，確定了最適的沉淀梯度并采取了二步鹽析，在提純SOD的同時也損失了部分目標產品。結果表明，本實驗將體系放大為90 L后，依然可以從鈍頂螺旋藻中獲得SOD，且通過優化工藝，顯著提高了SOD的比活力。該結果也證明，本實驗所建立的SOD中試生產方法是可行的。

表1 螺旋藻SOD的中試純化結果

2.2 不同飽和度硫酸銨鹽析對螺旋藻中SOD酶活力的影響

SOD溶液在飽和度為40%～90%范圍內的硫酸銨中每隔10%梯度進行鹽析，獲得沉淀。對沉淀進行復溶后脫鹽，再測定其SOD活力，結果如圖2所示。由圖2可見，在飽和度為40%～70%的范圍內，隨著硫酸銨溶液飽和度的增加，SOD活力不斷提高，在飽和度為61%～70%的硫酸銨中，SOD活力達到最高。此后，SOD活力隨硫酸銨溶液飽和度的增加而降低。因此，在第一步鹽析中，選擇飽和度為0～60%的硫酸銨對SOD溶液進行鹽析除雜；在第二步鹽析中，選擇飽和度為61%～70%的硫酸銨對SOD溶液再次進行鹽析，然后取沉淀復溶，再使用柱層析對其進行脫鹽，最后得到活力最強的SOD。

2.3 DEAE離子交換色譜柱層析

使用GE AKTA Pure半制備型蛋白純化儀系統對活力最強的SOD進行DEAE柱層析，結果如圖3所示。根據SOD活力曲線，合并SOD活力大于500 U/mg的試管中溶液，即合并第23～39管，得到SOD活力的平均值大于2 156 U/mg的溶液。

2.4 SuperdexTM200凝膠過濾柱層析

使用GEAKTA Pure半制備型蛋白純化儀系統對SOD活力平均值大于2 156 U/mg的溶液進行SuperdexTM200凝膠過濾柱層析，結果如圖4所示。根據SOD活力曲線，合并SOD活力大于4 000 U/mg的試管中溶液，即合并第16～23管，得到SOD活力的平均值大于4 131 U/mg的溶液。

2.5 SDS-PAGE分析

將最終得到的SOD酶液進行SDS-PAGE電泳分析，結果如圖5所示。由圖5可見，螺旋藻中SOD的分子質量約為18.4 ku，有且僅有唯一一條條帶，為僅含有一種亞基的SOD。

2.6 重復實驗驗證

如表2所示，3次重復實驗均可從螺旋藻中分離提純得到SOD，且平均酶活力均大于4 000 U/mg。

表2 3次重復實驗的結果

3 結論

本實驗按照兩步鹽析法、DEAE離子交換色譜柱層析和SuperdexTM200凝膠過濾柱層析法的分離純化順序，從螺旋藻中分離純化獲得高比活力的SOD，且通過3次重復實驗證實了本文方法的穩定性和可靠性。實驗所得的SOD酶液平均比活為4 131 U/mg，回收率為8.3%，純度提高了238.96倍。由SDS-PAGE電泳分析可知，純化所得SOD蛋白質的分子質量約為18.4 ku，為僅含一種亞基的SOD。