蜂巢培養系統在細胞擴增培養過程中的優勢與應用

程錦生

（上海東富龍醫療裝備有限公司，上海 201108）

關鍵字：細胞藥品化；蜂巢培養系統；合規性；成本控制；規模化

細胞治療即來源于人自體或異體的體細胞，經體外操作后回輸（或植入）人體的治療方法[1]。細胞治療產品是指人源的活細胞產品，包括由細胞系，以及來源于自體或異體的免疫細胞、干細胞和組織細胞等生產的產品[2]。據不完全統計，目前全球有超過1 000項已獲批或正在研究的細胞療法，其中占比最大的當屬免疫細胞治療中的嵌合受體抗原T細胞（CAR-T）以及干細胞療法中的間充質干細胞MSC細胞治療產品，是細胞治療的典型代表。我國2020年CDE共受理了25個細胞治療產品的IND申請，其中CAR-T類產品為14個，間充質干細胞產品5個，占據細胞治療產品的絕大多數。雖然國內暫無上市的細胞治療產品，中國的細胞治療產品距離上市越來越近，在2021年有望出現第一個批準上市的CAR-T產品。

細胞治療及細胞技術產品的創新發展，對監管法規提出了巨大挑戰。對于細胞治療產品監管政策，我國在不斷摸索中逐漸建立完善，2009年國家衛生部首次將部分免疫細胞治療納入第三類醫療技術進行準入管理，2017年12月22日，原國家食藥監總局發布《細胞治療產品研究與評價技術指導原則（試行）》，法規指出：“細胞治療產品可按照藥品管理相關法規進行研發和注冊申報”，并在藥學研究、非臨床研究、臨床研究等方面進行了細化的規范指導[3]，該法規標志著我國正式開啟細胞治療產品的注冊上市流程。2018年2月9日藥品評審中心組織召開了“CAR-T細胞治療產品申報臨床試驗藥學研究和申報資料基本要求”研討會，形成了《細胞治療產品申請臨床試驗藥學研究和申報資料的考慮要點》，該文件對生產原料、生產工藝、質量及穩定性研究等要點進行闡述，為同類藥品的研發和申報資料準備提供參考[4]。在此之后，又相繼出臺了一系列法規，對細胞治療的藥品管理法規進行進一步完善，基本實現細胞治療產品從醫療技術向藥品的轉化，奠定了細胞治療藥品化的基礎。

細胞治療產品藥品化生產標志著細胞產品生產方式的巨大轉變，細胞產品的生產與質量控制體系需要根據GMP藥品法規進行改革，針對生產過程中的關鍵因素，人、機、物、法、料、環的管控以及各個制備生產階段，都需要按照GMP法規進行適應性變化，因此，細胞治療產品藥品化生產是對細胞治療產品的系統性挑戰，是細胞生產作業方式的全面、系統、規范化的升級改革。如何確保GMP合規性并同時滿足成本控制及規模化要求是每個細胞治療機構面臨的共同問題。尤其在儀器設備方面，細胞治療藥品化生產的GMP法規挑戰尤其嚴峻，傳統化細胞生產設備目前已滿足不了GMP法規、規模化及成本控制要求，尤其在細胞培養上，傳統的細胞培養設備功能設計未考慮GMP法規要求，安全性及數據追溯存在不足，多數設備僅供研究使用，而且不符合成本控制及規模化生產要求，亟待革新。蜂巢培養系統經過我們長期測試研發，在充分考慮GMP合規性的基礎上，重點關注成本控制及生產效率提高，配合自主GMP全站系統設備使用，是細胞藥品化及規模化生產的有效解決方案。

1 蜂巢培養系統及其優勢

蜂巢培養系統即集成獨立密閉可擴展培養箱功能單元、GMP符合性上層控制及完整數據追溯系統及蜂巢式主體結構框架于一體的細胞治療產品細胞培養生產系統設備，在滿足醫用二氧化碳培養箱法規對工作環境、外觀及結構、氣體濃度及溫濕度控制等要求的基礎上[5-6]，可實現不同類型/批次細胞治療產品物在同一系統設備下同時相互隔離培養，在密閉隔離條件下提供細胞培養所需環境條件同時，滿足GMP對軟件系統控制及數據管理及追溯的要求。該系統主要分為電氣控制系統、RTP（無菌快速對接）培養箱及蜂巢式主體結構框架三個部分，如圖1所示。

圖1 蜂巢培養系統示意Fig.1 Beehive Incubator management system

1.1 電氣控制系統

蜂巢培養系統的電氣控制系統集電氣控制與數據管理為一體，系統通過主控制計算機實現對每一個RTP培養箱模塊實現獨立平行控制，提供細胞培養所需溫度、氣體及濕度環境。數據管理方面，系統具備三級權限設置及掃碼識別功能，可以生產批次為單位記錄所有相關操作信息并以工作日志體現，滿足FDA電子記錄和電子簽名相關要求。電氣控制系統與RTP培養箱之間采用無線通訊（WIFI）技術實現信號連接，實時監控追蹤檢測培養過程中的關鍵培養技術參數，并在異常出現時及時預警，提醒人工干預，所有培養參數可按照指定取樣間隔進行自動化整理歸納，形成連續式批培養生產記錄。

1.2 RTP（無菌快速對接）培養箱

蜂巢培養系統的RTP培養箱模塊，每個模塊都是獨立的培養控制單元，RTP培養箱是密閉的培養系統，氣體進出均采用0.22微米空氣過濾器，使之與其他RTP培養箱模塊實現空間上的完全隔離，可以實現多批次同時培養。RTP培養箱采用航天對接器的原理，將RTP（快速轉運接口）應用到培養箱上，可在密閉條件下與多設備實現無菌密閉式對接，在密閉無菌的環境下完成相應工藝工序。RTP培養箱系統采用過氧化氫滅菌，滅菌效果能達到6 log，在批次培養轉換時，可以對RTP培養箱腔體內部進行徹底滅菌。

1.3 蜂巢式主體框架結構

以類似蜂巢式的排列方式對RTP培養箱模塊進行組合排列，有效利用空間，提高空間利用率。

比較傳統的細胞培養箱，蜂巢培養系統在細胞治療產品藥品化生產應用上具備諸多優勢，首先體現在GMP合規性上，蜂巢培養系統是可自動化滅菌的密閉式培養設備，可有效減少污染和交叉污染風險。蜂巢培養系統配功能完備的電氣控制系統，能夠實現培養過程的全程監控與控制，生成可供追溯的記錄。其次是成本控制及生產效率，蜂巢培養系統屬于密閉培養設備，根據《GMP附錄-細胞治療產品》法規要求，蜂巢培養箱的背景環境可以為D級潔凈環境并且滿足多批次同時培養要求，再者蜂巢培養箱系統的蜂巢式結構可有效提高空間利用率，因此可以大幅減少廠房投入并提高生產效率。

2 蜂巢培養系統在細胞藥品化生產中的應用

蜂巢培養系統的設計功能滿足多種細胞治療產品的藥品化生產工藝要求，包含但不限于各種免疫細胞及干細胞產品。為了驗證蜂巢培養系統在細胞治療產品生產中的實際應用效果，依托東富龍生物技術模擬驗證實驗室，以傳統培養箱為對照組，選擇細胞治療產品的代表性培養生產工藝對蜂巢培養箱功能進行驗證測試，驗證測試D級環境背景下蜂巢培養系統的細胞培養效果以及無菌性保證，進而確認其是否能夠滿足細胞藥物制備生產規范及工藝的要求。

2.1 人外周血來源的T淋巴細胞制備測試驗證

2.1.1 驗證方案

按照T淋巴細胞制備標準作業規程進行T擴增放大培養。當細胞總數達到2×109以上時，按1×106mL接種至10個225 T的培養瓶，平均分為2組，每組5個樣本，標注蜂巢培養系統及傳統培養箱組并編號后，分別置于后分別置于傳統培養箱、蜂巢培養系統中培養，每天取樣檢測記錄細胞數，每3 d按照1×106進行擴增，培養完成后進行內毒素及無菌檢測測試，并對比最終細胞收獲量及細胞生長過程曲線。

2.1.2 驗證結果

2.1.2.1 T細胞生長記錄

表1 T細胞生長記錄（數據來自驗證實驗室）Tab.1 T cell expension daily test records

圖2 T細胞生長曲線對比（數據來自驗證實驗室）Fig.2 T cell expension profile

2.1.2.2 內毒素及無菌檢測，見表2。

表2 T細胞內毒素及無菌檢測記錄（數據來自驗證實驗室）Tab.2 T cell endotoxin and sterility test records

2.1.2.3 驗證結論

蜂巢培養系統組與傳統培養箱組培養組T細胞的擴增生長曲線基本一致，從生長曲線上看，第6天開始，蜂巢培養箱組的細胞擴增生長速度占據一定優勢。經過11 d的培養后，T淋巴細胞的活細胞總數（TNC）分別為（29.16±2.24）×109與（31.50±0.99）×109，P= 0.080（P＞0.05）。蜂巢培養箱組獲得的T細胞活細胞總數（TNC）高于傳統培養箱，但兩者無顯著差異（P＞0.05）。內毒素及無菌檢測結果均為陰性，蜂巢培養系統能夠有效提供無菌保障。

結論：D級環境背景下蜂巢培養系統可以根據需要提供適宜的T生長環境及無菌性保證，滿足以T細胞治療產品制備生產工藝要求。

2.2 人臍帶來源的間充質干細胞傳代培養測試驗證

2.2.1 驗證方案

凍存的臍帶間充質干細胞（MSCs）P3代種子細胞，按照臍帶間充質干細胞制備標準作業規程處理，P3代種子細胞解凍復蘇后按4 000 cm2的密度接種至10個175 T的培養瓶中，平均分為2組，每組5個樣本，標注蜂巢培養系統組及傳統培養箱組并編號后，分別置于傳統培養箱、蜂巢培養系統中培養，第3天觀察拍照記錄并換液，第6天觀察并進行消化收集，計算細胞收獲量，之后按4 000 cm2接種繼續培養，培養完成后對細胞進行內毒素及無菌檢測測試，并對比最終細胞收獲量、細胞生長情況及二倍增長時間。

2.2.2 驗證記錄

2.2.2.1 MSCs細胞生長記錄

圖3 MSCs活細胞總數（TNC）對比（數據來自驗證實驗室）Fig.3 Total number of viable MSCs

2.2.2.2 內毒素及無菌檢測

表3 MSCs內毒素及無菌檢測記錄（數據來自驗證實驗室）Tab.3 MSCs endotoxin and sterility test records

2.2.2.3 驗證結論

連續2代MSCs細胞培養，蜂巢培養箱組所獲得的MSCs活細胞總數（TNC）均高于傳統培養箱組，但二者均無明顯差異（P＞0.05）。代次一，蜂巢培養箱組MSCs細胞的二倍擴增時間明顯低于傳統培養箱組（P＜0.05），代次二，蜂巢培養箱組MSCs細胞的二倍擴增時間低于傳統培養箱組，但二者無顯著差異（P＞0.05）。內毒素及無菌檢測結果均為陰性，蜂巢培養系統能夠有效提供無菌保障。

結論：D級環境背景下蜂巢培養系統可以根據需要提供適宜的MSCs生長環境及無菌性保證，滿足以T細胞治療產品制備生產工藝要求。

2.3 蜂巢培養系統在細胞藥品化生產中的應用總結

T細胞及MSCs培養是細胞治療產品培養生產的典型代表，分別代表了免疫細胞治療及干細胞治療培養技術，其培養的參數條件要求同樣適應于其他細胞治療產品培養。驗證結果表明蜂巢培養系統在滿足法規的基礎上，可根據需要提供適宜的T細胞、MSCs生長環境及無菌性保證，滿足細胞藥品化生產的培養工藝要求，該結論也同樣適應于其他細胞治療產品。因此，蜂巢培養箱系統可廣泛應用于多種細胞治療產品的細胞藥品化生產。

3 結束語

蜂巢培養系統從GMP合規性出發并結合細胞培養生產工藝要求，滿足多種細胞培養工藝要求并大幅提高生產效率，是細胞藥品化、規模化生產的有效解決方案，可廣泛應用于多種細胞治療產品的藥品化生產。我國目前大多數細胞治療技術產品處于研發及IND申報階段，蜂巢培養箱系統的法規符合性優勢，可有力支持研發和IND申報，進而推動細胞治療產品發展。