抗水通道蛋白AQP4單抗的制備及其初步應用

趙迪，張玉麗，康慧穎，曹啟江

(1.沈陽大學生命科學與工程學院，遼寧省城市有害生物治理與生態安全重點實驗室，沈陽 110044；2.遼寧何氏醫學院基礎醫學院，沈陽 110163)

視神經脊髓炎(neuromylitis optica，NMO)是一種免疫介導的慢性炎癥性疾病，主要累及視神經和脊髓原發性中樞神經系統炎癥脫髓鞘[1-3]。國內外研究確認NMO為一種嚴重的神經系統退行性疾病，但是針對NMO疾病發生的具體分子機制還不明確[4-7]。臨床發現絕大多數視神經脊髓炎譜系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorder，NMOSD)患者血測可檢出水通道蛋白4(aquaporin，AQP4)自身抗體，IgG-AQP4已成為診斷該疾病的重要標志物之一[8-9]。AQP4自身抗體的細胞毒作用與疾病的發生和發展有密切的聯系。研究[10-12]發現AQP4自身抗體含量濃度較低的患者能夠獲得較好的治療，減輕AQP4自身抗體介導的細胞毒作用將成為治療NMOSDs的有效方法之一。

目前，針對NMOSDs急性期患者的治療方法主要為大劑量激素沖擊、靜脈注射大劑量免疫球蛋白和血漿置換等[13-14]。大劑量糖皮質激素長時間使用會降低機體的免疫能力，增加誘發感染或加重感染的風險；注射大劑量免疫球蛋白目前還缺少足夠的證據支持治療的有效性；血漿置換過程中在減少AQP4自身抗體的同時也降低了其他治療方式的作用效果[15]。針對NMOSDs緩解期患者的治療方法主要為使用免疫抑制劑、利妥昔單抗以及個體化治療或對癥治療，但是不確定能夠穩定有效。因此，本研究制備單克隆抗體，經酶聯免疫吸附測定實驗和免疫組織化學實驗證實其能特異性識別人的AQP4蛋白，為后期利用分子生物學技術制備人源化抗體或者小分子抗體打下基礎。進而為利用人源化或者小分子抗體結合AQP4表位屏蔽體內自身抗體與AQP4的結合來保護星形膠質細胞免受細胞毒作用，抑制中樞神經系統炎癥脫髓鞘，進而達到治療視神經相關性疾病奠定了理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

6～8周齡BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗過程中所有處置均按照動物倫理學標準執行。

1.1.2 實驗試劑與儀器

牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA、卵清蛋白購自德國默克BDH公司；RPMI-1640細胞培養基、Freund不完全弗氏佐劑、HAT、HT選擇性培養基、聚乙二醇PEG、堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase，AP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，BCIP)、四唑淡藍(nitro-blue-tetrazolium，NBT)、山羊抗小鼠IgG-FITC和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG-HRP均購自默克中國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液PBS、PBST、封閉液以及顯色底物等為本重點實驗室配制和留存；細胞培養瓶、吸管、試管、滴管、培養皿、燒杯、1 mL注射器、96孔細胞培養板、眼科剪、眼科鑷、EP微量移液器均購自耗材公司；科研超凈工作臺購自蘇州凈化設備公司；CO2恒溫培養箱購自日本Sanyo公司；DW-60W451EU超低溫冰箱、BCD-257 SL低溫冰箱(Haier)；純水裝置(Millpore)；SHZ-III型循環水真空泵購自上海亞榮生化儀器廠；GF-300電子天平購自賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；Eppendorf centrifuge5810R離心機購自德國Eppendorf公司；PCR儀購自美國Thermofisher公司；Power Wave XS2酶標儀德國BioTek公司；Ti-U DS-2 CCD尼康倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司；石蠟切片機購自德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 AQP4 優勢抗原表位多肽合成

AQP4蛋白氨基酸序列多達6個跨膜區，原核表達蛋白難度相對很高，我們通過蛋白表位分析抗原優勢表位后[16]，借助普健生物科技有限公司(武漢)，采用多肽合成的方法偶聯KLH作為抗原，合成多肽選擇的氨基酸序列如表1所示。

表1 合成多肽氨基酸序列Table 1 Amino acid sequence of AQP4 synthetic peptide

1.2.2 動物免疫

將合成的多肽1 和多肽2 等體積與完全佐劑充分混合，對BALB/c雌性小鼠背部皮下4～6點注射50 μg蛋白/只，共免疫5只小鼠。初次免疫2周后注射25 μg/只加強免疫，再過兩周后再次注射25 μg/只加強免疫，再過1周后進行抗血清效價檢測，選取效價＞32000小鼠1周后進行4免(表2)后斷尾采血10 μL，加入到990 μL PBS緩沖液中，混勻5000 r/min離心10 min，保留上清備用。間接ELISA測定血清效價，選擇效價高和靈敏度好的小鼠進行下一步細胞融合。

表2 小鼠4次免疫時間與抗原劑量安排Table 2 Four times of immunization and the schedule of antigen dosage

1.2.3 細胞融合及篩選

挑選血清免疫結果較好的小鼠進行細胞融合，融合1～2次，每次融合進行2～3輪ELISA篩選，得到單克隆后建株，至少建株4株。

1.2.4 腹水生產及純化

將得到的陽性單克隆細胞株打小鼠腹水，每株純化2～5 mg抗體，利用蛋白免疫印跡以及ELISA進行抗體效價檢驗測定。

1.2.5 單抗親和力和特異性鑒定

1.2.5.1 AQP4 單抗ELISA 檢測

用合成多肽2.5 μg/L包被96孔板，100 μL/孔，37 ℃ 2 h或者4 ℃過夜。然后PBS漂洗5次，加入3%BSA-PBS 4 ℃封閉過夜，300 μL/孔，PBST洗3～5次，300 μL/孔。將各個單抗加入酶標板，100 μL/孔，室溫反應1h，PBST洗3次。加入帶有辣根過氧化物酶HRP標記的親和純化山羊抗小鼠IgG的二抗，100 μL/孔，37 ℃ 30 min，PBST洗3次。加入底物顯色液四甲基聯苯胺(TMB)，100 μL/孔，室溫顯色5～15 min，加入稀硫酸終止反應，50 μL/孔。酶標儀測OD450數值。

1.2.5.2 AQP4 單抗蛋白免疫印跡檢測

合成多肽加入2×Sodium dodecyl sulfate (SDS)裂解液，每泳道10 μL上樣。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，利用硝酸纖維素膜進行轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，利用獲得的單抗4℃孵育過夜。次日，利用PBST洗3次，加入帶有AP標記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，0.5%脫脂奶粉清洗3次，加入堿性磷酸酯酶顯色，將BCIP/NBT用AP緩沖液稀釋10顯色5～15 min。

1.2.5.3 AQP4 單抗免疫組織化學實驗

將患者與正常人的石蠟切片在55 ℃恒溫箱中烘烤30 min，組織切片置于二甲苯中浸泡15 min，更換新的二甲苯再浸泡7 min，通過梯度酒精從100%、95%、90%、75%乙醇中分別浸泡5 min，然后將切片置于0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液中(pH 6.0)，經過封閉液室溫封閉10 min，滴加一抗，4 ℃孵育過夜或者37 ℃ 1 h，PBS洗3次，每次3 min，滴加生物素標記的二抗，室溫孵育30 min后，PBS洗3次，每次3 min；滴加鏈霉卵白素，室溫30 min后，PBS洗3次，每次3 min；DAB顯色，蒸餾水水洗后蘇木素復染，水洗后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片鏡檢。

2 結果

2.1 AQP4 多肽合成

將合成質量20 mg，純度90%以上的兩個多肽偶聯KLH后用作抗原免疫小鼠，合成多肽的鑒定結果如圖1所示。

圖1 合成多肽的質譜鑒定結果Figure 1 Mass spectrometry identification results of AQP4 synthetic peptides

2.2 抗AQP4 單抗的純化及亞克隆

用合成的抗原肽免疫小鼠后，分離B細胞經過與骨髓瘤細胞融合和克隆篩選，最終獲得4株雜交瘤細胞株(圖2A所示為雜交瘤細胞)。收集小鼠腹水后進行抗體純化，利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳對其純度進行鑒定分析沒有其他雜蛋白，說明抗體純度較好(圖2B)。

圖2 雜交瘤細胞和抗AQP4單克隆抗體的純化Figure 2 Hybridoma cell and Purification of AQP4 specific monoclonal antibody

2.3 間接ELISA 血清學效價檢測

利用酶聯免疫吸附測定實驗中的間接實驗方法，將合成的多肽包埋在固相載體表面，加入獲得的抗體反應后再加入二抗，進行抗體血清效價，測定結果表明該抗體具有較高的效價(表3)。

表3 抗AQP4單克隆抗體的血清效價檢測Table 3 Serum titer of AQP4 specific monoclonal antibody

2.4 抗AQP4 單抗與AQP4 反應的特異性檢測

為檢測所獲單抗與AQP4反應的特異性，利用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)空蛋白作為對照，合成多肽蛋白作為抗原跑SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳，轉膜后利用獲得的抗AQP4單克隆抗體和抗GFP的抗體進行蛋白免疫印跡實驗，結果顯示抗體可與相應的AQP4特異結合(圖3)。

圖3 抗AQP4單克隆抗體與AQP4反應的特異性檢測Figure 3 Detection specificity of AQP4 specific monoclonal antibody reacting with AQP4

2.5 抗AQP4 單抗與組織切片免疫組織化學實驗

對眼部組織石蠟切片進行免疫組織化學實驗(圖4)，抗AQP 4 單克隆抗體可以標記結合組織切片中的相應抗原，尤其在眼部腫瘤患者組織切片中標記的量明顯高于正常人的眼組織。

圖4 抗AQP4單克隆抗體的免疫組織化學(標尺50 μm)Figure 4 AQP4 specific monoclonal antibody practise via immunohistochemical staining (bar,50 μm)

3 討論

本研究通過合成多肽抗原，免疫小鼠獲得抗AQP4優勢抗原表位的B細胞，將該B細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，對雜交瘤細胞篩選和亞克隆，經過蛋白免疫印跡實驗和血清學效價檢測鑒定篩選出4株能夠分泌特異性較好的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。利用該單克隆抗體進行免疫組織化學實驗，發現AQP4在患者眼組織切片中被標記的顯著高于正常人組織切片，實驗表明該單克隆抗體與AQP4具有較高的親和力和特異性。

視神經脊髓炎是一種免疫介導的慢性炎癥性疾病，主要累及視神經和脊髓原發性中樞神經系統炎癥脫髓鞘。結合體液免疫的理論知識，抗體可通過激活補體經典途徑而引發對抗體結合的靶細胞發生細胞毒作用，或者通過調理作用激活巨噬細胞發揮吞噬作用以及激活NK細胞發生抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用來破壞抗體結合的靶細胞，這是從免疫學角度揭示細胞毒作用發生的機制。IgG-AQP4已成為診斷該疾病的重要標志物之一，其中絕大多數患者血測可檢出AQP4自身抗體。而目前，關于AQP4的國內外研究主要集中在該蛋白相關疾病的研究[4,17-18]。關于抗AQP4的抗體研究的比較少，也主要注重該抗體的發病機制研究[19]。

從免疫學抗體拮抗的角度出發，利用體外獲得的抗體拮抗體內已經產生的自身抗體和利用小分子抗體結合AQP4來屏蔽自身抗體的結合位點。由于小分子抗體不具有Fc片段，進而大大降低或抑制自身抗體的細胞毒作用。實驗后期利用單克隆抗體應用于動物模型，統計分析該抗體的作用效果后制備小分子抗體。盡管大量使用小分子抗體可能會增加機體相關血清病的發生，如果后期將人源化的抗體進行片段化或者生產人源化的小分子抗體就可以避免這種情況的發生。

綜上，本研究大膽推測后期通過利用人源化小分子抗體結合自身AQP4蛋白，抑制體內自身抗體特異結合抗原，降低或抑制抗體Fc片段引發的細胞毒作用，進而阻止視神經脫髓鞘的發生，達到預防或治療視神經相關性疾病的目的。因此，本研究中制備高親和力，高效價以及特異性強的AQP4-mAb，為后期制備抗AQP4的小分子抗體以及人源化小分子抗體奠定了理論基礎，并提供了技術支撐，為后期探索視神經脊髓炎相關疾病的治療方式提供思路。