活體共聚焦顯微鏡診斷角膜后部真菌感染與病理診斷的比較研究

孫大鵬，李東芳，孔倩倩，劉廷

(山東第一醫科大學附屬青島眼科醫院，山東省眼科學重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，山東 青島 266071)

真菌性角膜炎(fungal keratitis，FK)是世界范圍內常見的致盲性眼病，在我國北方地區真菌感染是感染性角膜病的首位致病因素[1]。臨床常見的角膜真菌感染患者通常伴有植物外傷史，可因角膜上皮和基質層的損傷形成角膜潰瘍，感染早期在未進行刮除和抗真菌藥物等治療手段時，真菌菌絲生長比較表淺，活體共聚焦顯微鏡可較容易在淺基質層查見典型的菌絲。文獻[2-3]中報道，活體共聚焦顯微鏡診斷真菌感染的陽性率達90%以上，明顯高于其他檢查方法。雖然活體共聚焦顯微鏡在診斷角膜基質淺層真菌感染中具有很高的陽性率，但當臨床上遇到角膜感染病灶位于深基質及內皮面的真菌感染患者，即角膜后部真菌感染患者時，真菌感染常較難確診。由于角膜淺基質層常缺乏明顯潰瘍病灶，角膜刮片檢查通常為陰性，且角膜后部真菌感染病灶可引起角膜基質水腫和混濁，給活體共聚焦顯微鏡檢查增加了診斷難度。部分患者最終需要通過術后病理標本檢查來得到確診。本研究對比角膜后部真菌感染的活體共聚焦顯微鏡檢查陽性率與臨床病理檢查結果，以期對角膜后部真菌感染的診斷有所幫助。

1 對象與方法

1.1 對象

回顧性分析2009年11月至2020年12月因FK在青島眼科醫院就診并行穿透性角膜移植手術治療的18例角膜后部真菌感染患者的臨床資料，其中男11例，女7例。年齡23～73(平均53.5)歲。視力為0.1至FC20 cm，眼壓15～20 mmHg(1 mmHg=0.133 kg)。所有患者行活體共聚焦顯微鏡檢查前均知情同意，本研究符合青島眼科醫院倫理委員會要求。

入選標準：選擇就診時角膜表面無明顯潰瘍，角膜病灶位于深基質及內皮面的患者，術前經共聚焦顯微鏡或術后經病理檢查診斷明確，包括病史、裂隙燈檢查符合典型的角膜后部感染體征。術前均行角膜刮片KOH涂片檢查和活體共聚焦顯微鏡檢查，術后病變角膜片進行病理組織切片和特殊染色檢查，根據角膜共聚焦顯微鏡檢查聯合術后病理確診為角膜后部真菌感染患者。排除標準：1)伴有全身免疫性疾病和感染性疾病；2)排除角膜前部感染性病變的患者。

1.2 活體共聚焦顯微鏡檢查方法

使用海德堡激光共聚焦顯微鏡(HRTIII德國海德堡公司)，觀察視野為400 μm ×400 μm，放大倍數為800，分辨率為1 μm。簡要檢查步驟：應用0.4%奧布卡因滴眼2次進行表面麻醉，開瞼器撐開眼瞼，患者坐位固定頭部，移動共聚焦顯微鏡物鏡對齊患者角膜病灶中央，微調物鏡看到角膜表層上皮定位為0 μm，勻速旋轉調節物鏡向前推進，間隔約10 μm深度采集各層角膜圖像，采集圖像最深度至約770 μm。所有檢查由同一名特檢科高年資醫師進行。

1.3 手術方式

綜合FK患者病情考慮，術前應用抗真菌藥物治療無效，感染癥狀持續進展，視力明顯下降。18例患者因感染嚴重侵犯角膜深基質層，前房炎癥反應重，前房積膿行穿透性角膜移植術。所有患者接受PKP手術，首先測量Fleischer環直徑的大小以確定鉆切植床的環鉆直徑，角膜環鉆鉆取，再以鉆石刀切透全層，前房注入縮瞳劑，以角膜剪取下病變角膜組織，將制備好的較植床直徑大0.25 mm角膜植片應用10-0尼龍縫線間斷縫合。在手術顯微鏡的自動散光盤指導下調整縫線，消除術中散光[4]。

1.4 角膜組織病理組織學檢查

穿透性角膜移植手術在術中切除病變角膜組織，組織經4%甲醛固定24 h以后，經病灶中心取材，從80%乙醇開始進行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋后切片，切片厚度4 μm，切片經二甲苯脫蠟后，梯度乙醇復水，蘇木精伊紅染色，中性樹膠封片。

1.5 組織過碘酸-Schiff法(periodic acid-schiff，PAS)

病變角膜組織切取4 μm石蠟切片進行PAS染色，簡略步驟如下：石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水，過碘酸染色10 min，水洗1 min，雪夫氏染色20 min，硫代硫酸鈉洗2 min，蘇木精復染細胞核，中性樹膠封片。觀察角膜內浸潤的真菌菌絲，發現有紅色菌絲為真菌感染陽性。

1.6 角膜組織六亞甲基四胺銀法(GMS)染色

病變角膜組織切取4 μm石蠟切片進行過六胺銀(Grocott Methenamine silver，GMS)染色，簡略步驟如下：石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水，8%鉻酸水溶液染色20 min，水洗1 min，0.5%偏重亞硫酸鈉液處理1 min，水洗后放入六胺銀工作液于60 ℃溫箱內60 min，至切片呈黃褐色，見角膜基質內真菌菌絲呈黑褐色為陽性。

2 結果

2.1 角膜后部真菌感染臨床表現和活體共聚焦顯微鏡檢查結果

患者發病前均有眼部角膜外傷病史，包括板栗刺傷、植物劃傷和異物碰傷等，最長病史達3個月，最短病史約1個月，平均為2個月。發病初期均有反復發作的眼紅、痛、視力輕度下降，刺激癥狀等表現。經治療后遷延不愈，病程后期癥狀加重，出現流淚、不能睜眼等體征，視力下降顯著，定位和紅綠色覺正常，角膜后部真菌感染患者體征表現為球結膜混合充血，可見角膜上皮尚完整，角膜水腫，病灶位于角膜中央或邊緣深基質內，病灶的內皮面可見白色圓形混濁浸潤，角膜病灶區內皮面大量膿液附著(內皮斑)，前房內滲出細胞，前房下方積膿。前節OCT檢查可見角膜基質水腫，炎細胞浸潤，深層基質混濁區域無法穿透。到本院就診后18例角膜后部真菌感染患者角膜刮片KOH涂片均未檢查到真菌菌絲，其中有16例患者經活體共聚焦顯微鏡檢查到真菌菌絲(88.9%)，活體共聚焦顯微鏡檢查在基質淺層未見樹枝狀菌絲，在深基質和內皮層查見典型的真菌菌絲伴炎細胞浸潤(圖1，2)。

圖1 典型角膜后部真菌感染患者裂隙燈、OCT及共聚焦圖像Figure 1 Representitive images of slit lamp,OCT and confocal microscope of retrocorneal fungal infection

大多數角膜后部真菌感染的病例在共聚焦顯微鏡下檢查均發現典型的深基質或內皮面菌絲，形態呈分枝狀，少數病例的共聚焦顯微鏡檢查圖片中最終僅查見單根菌絲(圖3)。術后真菌培養18例患者中有10例患者培養陽性(55.5%)，其中鐮刀菌占5 例，曲霉菌占3 例，鏈格孢霉菌占2例。

圖3 典型角膜后部真菌感染患者的激光共聚焦顯微鏡檢查圖像Figure 3 Representitive images of confocal microscope of retrocorneal fungal infection

2.2 組織病理學PAS 和GMS 染色檢查結果

患者穿透性角膜移植術后行病理檢查，病理切片HE染色可見角膜深基質層變性壞死，大量炎癥細胞浸潤，PAS染色聯合GMS染色在18例患者中均可檢查到真菌菌絲，角膜后部真菌感染PAS染色可見典型真菌菌絲侵犯角膜基質深層，而角膜基質淺層未查見真菌菌絲，GMS染色也可查見角膜基質中黑色的菌絲(圖4)。角膜后部真菌感染患者活體共聚焦顯微鏡、病理檢查和真菌培養診斷陽性率比較見表1。

表1 角膜后部真菌感染患者活體共聚焦顯微鏡、病理檢查和真菌培養診斷陽性率比較Table 1 Comparison of positive rates of in vivo confocal microscopy,pathological examination and fungal culture in retrocorneal fungal infection

圖4 角膜后部真菌感染患者的角膜組織病理學HE、PAS和GMS染色圖像Figure 4 Representitive images of HE,PAS and GMS stain

2例角膜后部真菌感染患者術前無法明確為真菌感染，術前活體共聚焦顯微鏡檢查在內皮面見大量團狀高反光，細節視不清，角膜基質水腫，可視圖像中未探及明顯病原體。角膜移植術后角膜組織病理切片進行PAS染色可見后彈力層后表面大量紅染、樹枝狀的菌絲，內見分隔(圖5)。

圖5 角膜深層真菌感染患者的裂隙燈、共聚焦及病理PAS圖像Figure 5 Representitive images of slit lamp,confocal microscope and PAS stain

圖2 典型角膜后部真菌感染患者裂隙燈及共聚焦圖像Figure 2 Representitive images of slit lamp and confocal microscope of retrocorneal fungal infection

3 討論

FK是國內角膜感染致盲的首要原因，及時診斷和治療是預防FK并發癥發生的關鍵。在活體共聚焦顯微鏡發明之前，角膜組織刮片進行KOH涂片是術前診斷FK的主要方法，而病理診斷是手術后診斷的唯一金標準。臨床常用的活體共聚焦顯微鏡是德國海德堡公司生產，其圖像最佳分辨率精度達1 μm，放大倍率達800倍[5]。活體共聚焦角膜顯微鏡具有快速、無創傷和可多次進行的優點，迅速在角膜組織觀察和病原體的診斷中發揮主導作用[4,6]。

活體共聚焦顯微鏡在診斷角膜真菌、阿米巴等感染性角膜病有獨特的優勢[7-9]，為臨床醫生提供手術依據，同時活體共聚焦顯微鏡對判斷抗真菌藥物治療效果，調整臨床治療方案也都提供客觀依據[10]。FK患者的感染病灶如果位于角膜深基質或內皮面，則稱為角膜后部真菌感染[11]。在我們報道的角膜后部真菌感染患者大多數具有明確的植物、飛蟲或者金屬等外傷病史，都應小心細致的檢查。角膜深層真菌感染患者通常角膜病灶混濁較嚴重，由于病灶位于深基質層，以及炎癥和內皮損害引起角膜水腫，影響了激光的穿透性和成像清晰度，因此病灶中心區域在活體共聚焦顯微鏡下往往成像不清晰，首先應著重針對病灶邊緣水腫較輕的區域進行掃描，其次應對患者角膜全層進行細致的掃描，特別是有明顯的角膜內皮面和前房積膿的患者，根據病灶的深度確定重點掃描的角膜后部范圍。

活體共聚焦顯微鏡對FK診斷的敏感性和特異性在不同文獻中報道略有差異[12]，Kanavi等[13]對133例感染性角膜炎患者進行檢查，活體共聚焦顯微鏡對FK診斷的敏感率約為94%，特異性為78%。Chidambaram等[14]的研究納入239例患者，活體共聚焦顯微鏡對FK診斷的敏感性和特異性分別為85.74%和81.4%。本研究納入的病例是真菌感染中較為少見的角膜后部真菌感染，其中有兩例患者在術前活體共聚焦顯微鏡未能明確診斷，診斷率大約為88.9%，究其原因最大可能性是由于患者炎癥反應重，角膜基質混濁明顯，菌絲位于基質貼近后彈力層甚至在前房內，深度可能超出活體共聚焦顯微鏡激光穿透能力以及儀器成像分辨率。在這種情況下，術后病理檢查就顯得尤為重要。

病理特殊染色PAS染色和GMS染色可將基底膜和糖原成分進行特異性染色，高歡歡等[15]使用了PAS染色和GMS染色可良好地顯示角結膜原位癌基底膜，其中PAS染色顯色更為鮮明，與背景反差更明顯，操作更為方便，認為其是一種理想的基底膜染色方法。在本研究的組織病理檢查PAS染色中可以清楚看到樹枝狀有分隔的菌絲結構。應用GMS染色也可觀察到對比清晰的菌絲。因此對于角膜后部真菌感染，病理學特殊染色檢查仍是不可或缺的檢查手段。因為真菌菌絲在HE切片中不能清晰的顯示，因此在臨床病理檢查中針對角膜切片中的菌絲常采用PAS染色，可以將真菌富含多糖的細胞壁清晰顯示，另外對角膜標本病灶區域的多張切片進行PAS染色，并結合GMS染色可明顯提高真菌檢出的陽性率，在18例角膜后部真菌感染患者中均檢查到菌絲。

有研究表明活體共聚焦顯微鏡診斷真菌感染陽性率與醫師臨床經驗有關系，Kheirkhah等[16]采集同一批真菌性和細菌性角膜炎患者的共聚焦圖像，比較不同臨床經驗的醫師應用共聚焦顯微鏡診斷FK的差別，臨床經驗豐富的診斷醫師發現共聚焦圖像中菌絲的敏感性為71.4%，而臨床經驗較少的診斷醫師發現菌絲敏感性僅為42.9%。表明診斷醫師的臨床經驗對共聚焦顯微鏡檢查結果有明顯的影響。活體共聚焦顯微鏡還可依據菌絲的形態進行初步的菌種鑒定[17]，活體共聚焦顯微鏡能觀察到鐮刀菌和曲霉菌感染的菌絲分枝夾角有差別，可通過菌絲分枝的角度來初步區分鐮刀菌和曲霉菌感染，曲霉菌為有隔菌絲組成，菌絲分叉呈45°，而鐮刀菌菌絲分叉角度為90°。但是也有新近研究[18]對98例FK患者進行研究，共聚焦顯微鏡下鐮刀菌分叉角度59.7°和曲霉菌分叉角度63.3°之間并無明顯差距，不能作為區分的標準。

綜上所述，共聚焦顯微鏡在FK的診斷具有無創、快速、可重復進行等獨到優勢，但在角膜后部感染病變的診斷中有一定的局限性，其次由于活體共聚焦顯微鏡無法對角膜組織進行染色顯影，不能確定真菌的種屬、類別，因此仍然需要與培養及組織病理檢查等手段結合起來，共同提高對FK的診斷率。