前列腺素EP4受體激動劑HY-128686對實驗性缺血性腦梗死的神經保護作用*

羅彩琴 荊 忻 沈 佳 馬曉薇 朱金源

（寧夏醫科大學總醫院重癥監護室，銀川 750004）

腦梗死是常見致死疾病之一，其中87%為缺血性腦梗死[1-2]。缺血性腦梗死由大腦主要動脈閉塞導致，從動脈支配的中心區細胞壞死持續到周圍半影區[3]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）異常生成會激活金屬基質蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）[4-5]。MMP-9 通 過 破壞血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的完整性，引起免疫細胞的炎癥反應和滲透，加速組織損傷[6-8]。研究表明MMP 在炎癥介導的神經血管損傷中至關重要，而敲除或抑制MMP-9 表達可以顯著降低腦缺血后的神經血管損傷[9-10]。前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）是4 個G 蛋白偶聯受體EP1-EP4 的內源性配體，具有旁分泌或自分泌效應，對炎癥信號至關重要[11]。缺血性腦梗死后，磷脂酶從膜上釋放大量花生四烯酸，然后進一步代謝為包括PGE2 的幾種前列腺素進而導致血腦屏障通透性改變和周圍免疫細胞滲透[12-14]。HY-128686 是有效的、選擇性、可口服的前列腺素E2 受體亞型4（EP4）激動劑。它對EP4 的選擇性比其他類前列腺素受體高4 000 倍[15]。有研究顯示EP4 激活能夠通過cAMP 及Wnt 等信號通路促進CD34+細胞的抗凋亡和增殖作用以減少炎癥及促進血管生成等作用[16]。本研究旨在通過檢測在短暫性局灶性腦缺血的臨床相關動物模型中使用EP4 受體激動劑HY-128686，觀察對腦組織IgG、MMP-9、IL-1β 以及IL-6 表達變化，研究HY-128686 對腦梗死神經保護作用。

1 材料和方法

1.1 動物

成年雄性大鼠60 只，6～8 周齡，280～320 g，購自溫州醫科大學動物實驗中心，飼養于溫州醫科大學動物實驗中心，在12 h 光照/黑暗周期下自由飲食飲水，溫度保持在18 ℃～26 ℃，濕度40%～70%，每籠2 只大鼠。所有動物程序均遵守大學實驗動物護理和使用指南，實驗方案經過大學動物護理使用委員會以及倫理委員會批準。

1.2 線栓法短暫性局灶性腦缺血大鼠模型

使用短暫性局灶性缺血的線栓法模型對大鼠進行90 min 的短暫性腦中動脈閉塞（MCAO）。醫用級氧氣中添加2%～2.5%的異戊烷深度麻醉大鼠，手術過程中使用恒溫加熱臺（Global Industries，美國）維持37℃。頸中線切口后從迷走神經中分離出頸總動脈（CCA），并用4-0 絲線縫合結扎（Holliston，美國）。臨時用微血管夾夾住頸外動脈和翼腭動脈，在結扎上方CCA 上進行動脈切開術，通過頸內動脈向上插入4-0 硅酮包覆線（Doccol Corporation，美國）進入大腦中動脈直到檢測到輕微阻力。暫時關閉切口，讓大鼠在恒溫加熱室（Paso Robles，美國）中恢復約80 min 后進行后續操作。

1.3 藥物處理

HY-128686 購自美國Cayman Chemical 公司，線栓法短暫性局灶性腦缺血大鼠模型建立后，使大鼠在恒溫加熱室（Paso Robles，美國）中恢復約80 min，動物隨機分組，每組10 只：使用不同劑量的HY-128686（0～1.2 mg/kg，溶于5 mL 生理鹽水中），尾靜脈注射處理大鼠；對照組大鼠靜脈注射等體積生理鹽水，每日注射1 次，持續處理21 d，處理結束后頸椎脫臼處死大鼠。

1.4 組織收集和裂解均質

使用戊巴比妥（150 mg /kg；i.p）（碧云天試劑公司，中國）深度麻醉后頸椎脫臼法處死大鼠，放入4℃的生理鹽水。使用腦模具（Zivic Instruments，美國）提取大鼠大腦，并切割為2 mm 切片。第4 切片對應前囟，為該模型腦梗死核心區域，將其切成同側和對側皮層以及同側和對側下皮層后在干冰上冷凍用于ELISA 、RT-PCR 和免疫印跡檢測。剩余的切片用于計算梗死面積。

將組織稱重并用組織裂解器在放射免疫沉淀緩沖液中勻漿，每mg組織中添加10 μL 1%十二烷基硫酸鈉（SDS）、1%脫氧膽酸鈉（碧云天試劑公司，中國）；150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl（pH=7.6）和1%的IGEPAL RCA-630（百奧萊博試劑公司，中國）；裂解后每毫升裂解混合物添加10μL HALT 蛋白酶抑制劑混合物、HALT 磷酸酶抑制劑混合物和0.5 mol/L EDTA（Thermo Fisher，美國）。用Vibra-CellTM超聲儀（Sonics＆Materials，美國）處理樣品2 次，每次15 s，冰上孵育15 min后，4℃，14 000 r/min，離心20 min。吸取上清液于EP 管，-80℃下保存至使用。

1.5 梗死面積及體積檢測

將腦片1～3 和5～6 在2%的2，3，5-三苯基四唑氯化物磷酸鹽緩沖溶液（PBS，海派醫藥公司，中國）中室溫孵育30 min，然后置于4%多聚甲醛中染色，活組織染為紅色，死亡組織為白色。用HP Scanjet 8300（帕洛阿爾托公司，美國）掃描各切片，分辨率為600 dpi，除第3 片外均沿延髓側向下掃描切片。第3 切片沿尾側向下掃描，代表第4 切片延髓側。

使用Adobe Photoshop CS5（EG 公司，英國）將每個切片劃分紅色組織，腦梗死表面積（mm2）=對側紅色組織-同側紅色組織；總梗死體積=死組織總表面積（mm2）×切片厚度（2 mm）。

1.6 ELISA 試劑盒測定IgG 活性

按照制造商的說明，使用免疫球蛋白G（IgG）ELISA 試劑盒（圣克魯斯生物技術公司，美國）：每個反應孔中加0.05 mL 抗體結合蛋白A/G（圣克魯斯生物技術公司，美國）包被96 孔板，4℃孵育過夜。每孔添加50 uL 切片勻漿液，37℃ 孵育0.5 h。棄液后洗滌3 次，每孔中加入相應酶標抗體100 μL，37℃ 孵育0.5 h 后洗滌，加入100 μL 四甲基聯苯胺（TMB，圣克魯斯生物技術公司，美國），室溫孵育30 min，加入50 μL 終止溶液。使用酶標儀（艾森博奧公司，美國）測量450 nm 處吸光度。

1.7 免疫印跡檢測MMP-9 和緊密結合蛋白

使用5%β-巰基乙醇稀釋40 μg 總蛋白（1∶1 000），加熱變性10 min 后檢測緊密結合蛋白閉合蛋白；使用2%的β-巰基乙醇稀釋40 μg 總蛋白（1∶500）后檢測緊密結合蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）；使用5%β-巰基乙醇稀釋50 μg 總蛋白（1∶5 000），加熱變性10 min 后檢測MMP-9。

蛋白變性后上樣，0.1%SDS Tris-甘氨酸緩沖液中電泳通過Mini-PROTEAN TGX 凝膠電泳（15%，CST，美國），200 V，45 min；在10%甲醇的Tris-甘氨酸緩沖液中平衡10 min，25 V 下轉移到PVDF 膜上（Billerica，美國）。室溫下在含5%脫脂牛奶的TBS 中封閉1 h，然后在含5%脫脂牛奶的TBST 中與一抗4℃孵育過夜。用TBST 洗滌PVDF 膜4 次，在含0.01%SDS，5%脫脂牛奶的TBST 中（格魯斯特，中國）與山羊抗兔IRDye 800 CW（1∶3 000，西格瑪奧德里奇公司，美國）室溫孵育1 h。TBST 洗滌去除多余抗體，與β-肌動蛋白一抗（1∶1 000，西格瑪奧德里奇公司，美國）室溫孵育2 h。TBST 洗滌4 次，在含0.01%SDS、5%脫脂牛奶的TBST 中與驢抗大鼠IRDye 680LT（1∶40 000，LiCor 公司，美國）室溫孵育1 h，然后用奧德賽紅外掃描系統（LiCor 公司，美國）進行掃描。以肌動蛋白信號為內參進行蛋白表達的標準化。

1.8 qRT-PCR

將第4 個切片（該模型腦梗死核心區域）對應組織切成同側和對側半球，并進一步分為紋狀體和皮層部分，放入RNA 穩定試劑（10 μL/mg 組織，Qigen，德國）。根據制造商的說明，采用TRIzol 法提取組織和細胞總RNA，紫外分光光度法檢測RNA 濃度和純度。用iScriptTMReverse Transcription Supermix（Integrated DNA Technologies，美國）將1 μg RNA 反轉錄為cDNA，并用IDTE 緩沖液（pH=8.0，Integrated DNA Technologies，美國）稀釋至10 ng/μL。分別使用20 ng 同側和對側半球紋狀體和皮層組織部分cDNA 進行qPCR，用IL-1β、IL-6、MMP-9 靶向探針（500 nmol/L，Integrated DNA Technologies，美國）進行探測。依據qPCR 說明書進行檢測，反應條件為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s；60℃45 s；70℃ 45 s，共40 個循環。qPCR 引物見表1。相應 mRNA 表達量檢測以參考基因（Ywhaz）進行歸一化處理。Ct 值以2-ΔΔCt方法進行計算，代表相應mRNA 的相對表達量。

表1 qRT-PCR 實驗引物序列

1.9 神經系統缺陷評估

在誘導MCAO 前以及藥物注射后2、7、14、21 d，對大鼠進行24 h 和48 h 的任務訓練，并在48 h 時進行測試。訓練大鼠去除前側以及對側爪上的小貼紙，記錄去除小貼紙的潛伏期，試驗重復3 次后取平均值進行分析，以此評估大鼠長期感覺。訓練大鼠使其停留在自動旋轉腳架上（4 r/min 加速到40 r/min），記錄大鼠跌倒潛伏期，試驗重復5 次后取平均值作為每只動物的基線值，以此評估精細運動控制缺陷。

1.10 統計學處理

使用GraphPad Prism 6.0版統計學軟件，分類變量以計數和百分比形式表示，進行χ2檢驗或Fisher精確檢驗進行分析；定量資料用±s表示，組間比較選用t檢驗。P<0.05時差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 梗死面積

與對照組相比，再灌注24 h 后，使用（0.2～1.2 mg/kg）HY-128686 治療后皮質和皮質下部分（P<0.05，圖1A、B）總梗死面積及體積（P<0.05，圖1C）顯著減少，提示1.0 mg/kg 的HY-128686 具有最好的療效，因此選擇此劑量處理的大鼠組織進行后續實驗。

圖1 使用EP4 質激動劑 HY-128686 治療后梗死面積

2.2 IgG 水平

每組大鼠的第4 張切片（2 mm 厚）的腦組織用于IgG 的ELISA 分析。與對照組相比，使用1.0 mg/kg HY-128686 治療后，皮質下和皮質中IgG 含量顯著降低（P<0.05，圖2）。

圖2 用EP4 激動劑HY-128686 治療腦梗死大鼠模型后大腦中IgG 含量

2.3 MMP-9、IL6、IL-1β 以及ZO-1 表達變化

免疫印跡檢測表明，與對照組相比，使用1.0 mg/kg HY-128686 治療后皮質中MMP-9 水平顯著降低（P<0.05，圖3），皮質下同樣明顯降低（P>0.05，圖3）；qRT-PCR 分析顯示，與對照組相比，使用1.0 mg/kg HY-128686 治療后皮質和皮質下IL-1β和IL-6 mRNA 顯著降低（P<0.05，圖4）。與對照組相比，使用 HY-128686 處理的大鼠同側皮質中ZO-1 表達升高（圖5）。

圖3 EP4 激動劑 HY-128686 治療后腦梗死大鼠模型中MMP-9 含量

圖4 HY-128686 處理后IL-1β、IL-6 mRNA 的表達

圖5 HY-128686 對ZO-1 蛋白的影響

2.4 對受損神經功能的長期保護

再灌注開始時，與對照組相比，靜脈注射1.0 mg/kg HY-128686的大鼠在梗死后1、2和3周的貼紙去除實驗中表現更好（P<0.05，P<0.01，圖6A），并且也停留在旋轉腳手架上的時間更長（P<0.05，圖6B），表明 HY-128686促進神經功能恢復。

圖6 HY-128686 治療腦梗死引起的神經系統損傷評估

3 討論

目前研究顯示MMPs 在組織修復、血管生成、細胞遷移以及組織形態形成中扮演著重要角色，其中MMP-9 是 MMPs 家族一員，具有廣泛的底物特異性，可有效降解Ⅱ、Ⅳ和Ⅸ型膠原蛋白，導致斑塊破裂形成血栓，同時以蛋白水解方式分解內皮細胞和基底膜細胞之間神經血管單元屏障功能所必需的緊密連接蛋白，改變血腦屏障（BBB）的通透性，使得腦實質中出現包括IgG 蛋白，影響缺血性腦梗死的發病過程[17]。

血管神經單元（neurovascular unit，NVU）包括神經元和由其參與構成的血腦屏障，發揮維持滲透性平衡的作用，使脈管系統進行物質交換[18]。血腦屏障由腦毛細血管內皮細胞、膠質細胞足突和基底膜組成，通過其特殊結構能阻擋病原生物和其他大分子物質由血循環進入腦實質，減少腦組織受到血液循環中有害物質的損害，從而維持腦組織內環境穩態平衡，發揮中樞神經系統保護功能。細胞質附著蛋白ZO-1、跨膜蛋白閉合蛋白和細胞骨架蛋白共同組成緊密連接，是血腦屏障的結構基礎，在維持血腦屏障結構發揮中樞神經穩態的重要作用[19-20]。本研究結果顯示與對照組相比，使用HY-128686 處理的大鼠同側皮層中ZO-1 表達升高，這說明HY-128686 能夠有效改善腦組織滲透性及發揮治療血腦屏障的作用。

腦梗死發生后神經血管細胞與外周免疫系統之間的細胞和分子之間的相互作用改變血腦屏障的通透性，引發炎癥反應以及免疫細胞浸潤，同時ROS 直接破壞組成BBB 的內皮細胞，并間接激活MMP，從而導致基底層蛋白和緊密連結蛋白水解降解，損害神經血管單元[21]。而本研究結果顯示，與對照組相比，使用1.0 mg/kg HY-128686 治療后皮層中MMP-9 水平顯著降低，皮質下也明顯降低；而qRT-PCR 分析顯示，使用1.0 mg/kg HY-128686治療后皮質和皮質下IL-1β 和IL-6 mRNA 顯著降低，表明HY-128686 治療后能夠有效改善腦梗死引起的免疫反應，減輕炎癥造成的腦損傷。

前列腺素類物質包括前列腺素和血栓烷素，是20 碳不飽和脂肪酸的環氧產物。EP 分為4 種亞型，分別為 EP1、EP2、EP3 和 EP4[22-23]。EP4 受體廣泛表達于內皮細胞、神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞和外周免疫細胞等多種細胞類型，為7 次跨膜激活型G 蛋白（Gs）-蛋白偶聯受體，激活后促進細胞內cAMP 水平升高進而激活蛋白激酶A（PKA），磷酸iNOS 水平，從而增加局部NO 濃度誘導血管舒張從而改變腦血流量[24]。EP4 受體激動后能夠抑制核因子-κB（NF-κB）的激活減少其靶基因IL-1β 轉錄[25]。另一項研究表明，在大鼠蛛網膜下腔出血模型中EP4 受體激動劑AE1-329 可顯著改善腦水腫以及減少炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達，從而保護腦損傷的發生[26-27]。同樣地這一現象在本研究中得到證實，本研究結果證明了HY-128686 能夠通過激活EP4 受體從而減少炎癥因子IL-1β 基因轉錄和MMP-3 和MMP-9 表達，同時抑制缺血性腦梗死誘導的炎性細胞因子IL-1β 和IL-6 的表達，從而抑制神經元凋亡，發揮神經保護作用。通過以上結果驗證了HY-128686 對腦梗死的治療作用，為未來的腦梗死治療提供了新的基礎數據。