妊娠期糖尿病中胎盤外泌體對滋養細胞增殖、細胞周期及凋亡的影響*

曾 燕 勾憲飛 陳曉燕 郝從莉

（1 重慶市第七人民醫院婦產科，重慶 400069；2 重慶市涪陵區婦幼保健院產科，重慶 408000；3 重慶市中醫院婦科，重慶 400021；4 成都中醫藥大學基礎醫學院，成都 611137）

近年，妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）的發病率隨著肥胖與2 型糖尿病發生率的增加也隨之升高[1]。國際糖尿病聯合會（International Diabetes Federation，IDF）調查結果顯示，我國2013年已超過100 萬GDM 患者，并嚴重危害母嬰健康[2]。然而，GDM 的具體病因及發病機制尚不明確。外泌體是在某些特殊生理或病理狀態下，母體細胞選擇性地將一部分生物信息物質（如蛋白、DNA、mRNA/miRNA/lncRNA、脂類等）包裹進直徑為40～120 nm 的脂質雙分子層囊泡內的一種物質，故外泌體因其特殊結構能夠介導不同細胞間的信息交流及物質交換。既往研究表明外泌體在胎盤發育、子宮螺旋動脈重塑及母體免疫耐受等過程中發揮重要作用[3-5]。有研究表明GDM患者的胎盤外泌體在濃度、成分及生物活性方面均較正常妊娠組不同，這提示胎盤外泌體可能對GDM 的發生發展、診斷和治療等具有重要意義[6-8]。有數據證實在GDM 患者的胎盤組織中，滋養細胞的數量、增殖能力顯著增加，同時細胞周期調控蛋白PCNA、cyclin D3 等表達明顯升高，而細胞凋亡卻顯著降低[9-13]，但滋養細胞上述行為改變是否受到胎盤外泌體的影響尚不明確。鑒于此，本研究分離純化GDM 患者血漿中胎盤外泌體，并在體外培養滋養細胞系HTR-8/SVneo，探討胎盤外泌體對滋養細胞增殖、細胞周期及凋亡的影響，以期從胎盤外泌體方面闡明GDM 的相關發病機制。

1 材料和方法

1.1 臨床標本、細胞系及主要試劑

選取2018年3月至2019年4月期間重慶市第七人民醫院50 例診斷為GDM 孕產婦患者（GDM組），GDM 診斷參考2013年世界衛生組織GDM 診斷標準[1]。另選同期50 例口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）陰性的孕產婦作為正常對照組。納入標準：（1）單胎妊娠；（2）排除患有其他妊娠期合并癥，如心腦血管、肺、肝、腎、甲狀腺等疾病及孕前即診斷為糖尿病或有糖尿病家族史；（3）均經陰道分娩。所有受試者均在分娩當日晨起時抽取空腹靜脈血5 mL，置于含有抗凝劑的紫色管中，靜置30 min 后，室溫下5 460 r/min離心5 min，取血漿置于試管中，30 min 內進行檢測或儲存于-80℃冰箱中，用于提取胎盤外泌體。本研究經過本院倫理委員會審批，患者及家屬均簽署知情同意書。

人絨毛膜滋養細胞系HTR-8/SVneo（HTR8）購自北京維通利華生物公司；DMEM/F12、0.25%胰蛋白酶（美國Hyclon 公司）；胎牛血清（FBS）、青鏈霉素混合液（杭州四季青生物公司）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（美國Invitrogen 公司）；TRIzol、逆轉錄試劑盒、外泌體RNA/蛋白提取試劑盒（美國Thermo 公司）；兔抗胎盤堿性磷酸酶（PLAP）、CD63、TSG101、GAPDH 單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG 二抗（北京中杉金橋生物有限公司）；PKH67 綠色熒光膜連接染料、DAPI 、MTT試劑盒（美國Sigma 公司）；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒（美國BD 公司）。

1.2 胎盤外泌體的提取及鑒定

取1 mL 血漿，參考相關文獻[7，14]利用超速離心與蔗糖密度梯度分離法相結合提取孕產婦外周血的外泌體后，使用二喹啉甲酸（BCA）法進行定量，-80℃保存備用。取20 μL PBS 稀釋2 μL 外泌體，3.5%的多聚甲醛固定后滴加到銅網上，2%的鈾酸鹽染色，晾干后應用透射電鏡（TEM）觀察外泌體形態；用950 μL PBS 稀釋50 μL 的外泌體，0.22 μm 濾膜過濾外泌體稀釋液后使用Nanosight 納米粒徑跟蹤分析（nanoparticle-tracking analysis，NTA）進行外泌體粒直徑檢測。

1.3 滋養細胞HTR8 細胞系培養及細胞分組

常規復蘇HTR8細胞后，使用含10 % FBS、1 %青鏈霉素的DMEM/HG 培養基于37 ℃、5 % CO2恒溫培養箱進行培養。待細胞生長融合至80%～90%時，用0.25 %胰酶進行消化傳代。取處于對數生長期的HTR8 細胞，調整細胞后以4×104個/孔接種于24 孔板中，并將細胞分為5 組：NP-10 μg Exo 組為含10 μg 正常妊娠組外泌體（NP-Exo）處理的HTR8 細胞；NP-20 μg Exo 組為含20 μg 正常妊娠組外泌體（NP-Exo）處理的HTR8 細胞；GDM-10 μg Exo 組為含10 μg 妊娠期糖尿病組外泌體（GDM-Exo）處理的HTR8 細胞；GDM-20 μg Exo 組為含20 μg 妊娠期糖尿病組外泌體（GDMExo）處理的HTR8 細胞；設含200 μL PBS 處理的HTR8 細胞為對照組。

1.4 PKH67/DAPI 雙染標記及追蹤外泌體

收集分離純化的外泌體，根據PKH67 試劑說明書進行標記外泌體，同時根據DAPI 染料說明書將HTR8 細胞進行染核，再將PKH67 標記的外泌體加入到經DAPI 染核的HTR8 細胞中，于37℃、5%CO2恒溫培養箱培養24 h，PBS 洗滌2～3 次后，熒光共聚焦顯微鏡進行觀察。實驗單獨重復3 次。

1.5 MTT 檢測細胞增殖能力

取各組對數生長期的HTR8 細胞，常規消化后按2×104個/孔接種于96 孔板中，分別于0、12、24、36、48 h 向每孔加入5 mg/mL 的MTT 試劑20 μL，培養箱中繼續培養4 h，棄除原培養液后，每孔加入150 μL 的二甲基亞砜（DMSO）溶液，室溫下震蕩10 min 使形成的紫色甲瓚結晶充分溶解。酶標儀于490 nm 檢測每孔吸光度值（OD490），每個時間點每組設置5 個復孔，取平均值，繪制細胞的生長曲線。

1.6 流式細胞術檢測細胞周期

取各組對數生長期的HTR8 細胞，調整細胞密度后以1×105個/孔接種于24 孔板中，于37℃、5%CO2恒溫培養箱培養48 h。培養終止后，4℃預冷的PBS 輕輕洗滌細胞后，并進行常規消化，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，收集細胞，加入500 μL的PBS 重懸細胞，并迅速加入3.5 mL -20℃預冷的70%乙醇，將細胞吹打均勻后，于4℃固定過夜。PBS 洗滌細胞3 次，2 000 r/min 離心5 min 以充分去除固定液，按照細胞周期流式細胞術檢測試劑盒說明方法進行操作，加入500 μL PI/RNase 染色液，4℃條件下避光孵育30 min，上流式細胞儀檢測各組細胞周期。實驗單獨重復3 次

1.7 Annexin V-FITC/PI 雙染色結合流式細胞術檢測細胞凋亡

取各組對數生長期的HTR8 細胞，調整細胞密度后以1×105個/孔接種于24 孔板中，于37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養48 h 后，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，4℃預冷的PBS 洗滌細胞2 次，1 500 r/min 離心5 min，收集細胞沉淀，用195 μL Annexin V-FITC 結合液重懸細胞，調整細胞至7×105/mL，依次加入5 μL 的Annexin V-FITC 及10 μL 的碘化丙啶（PI）染色液，輕輕搖晃離心管以充分混勻后，室溫下避光孵育30 min。300 目濾膜過濾細胞團塊后，上流式細胞儀檢測。實驗單獨重復3 次。

1.8 免疫印跡檢測胎盤外泌體標志蛋白的表達

應用外泌體RNA/蛋白提取試劑盒提取胎盤外泌體中的總蛋白。BCA 法進行蛋白定量，按照1∶4 向上清液中加入5×上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。取30 μg 的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白，采用濕轉法將分離的蛋白轉至PVDF 膜上，5%的脫脂牛奶于室溫下封閉2 h 后，分別加入CD63（1∶500）、PLAP（1∶800）、TSG101（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）一抗，4 ℃搖床孵育過夜。TBST 溶液清洗3 次，每次5 min，以辣根酶標記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，以 TBST 溶液清洗3 次，每次5 min。最后均勻滴加ECL 發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照。Image J 軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白與內參GAPDH 的比值作為其相對含量。以上實驗單獨重復3 次。

1.9 統計學處理

采用 SPSS 19.0 軟件進行統計學分析。計量資料采用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 孕產婦的一般臨床資料比較

與對照組相比，GDM 組的產前BMI、胎盤質量及新生兒體質量均顯著增加，差異均具有統計學意義（P<0.05），而平均年齡、分娩周數、新生兒性別差異均無統計學意義（P>0.05）（表1）。

表1 兩組孕產婦一般臨床資料比較

2.2 胎盤外泌體的鑒定

TEM 觀察顯示，胎盤外泌體呈典型的杯狀或雙凹狀形態，直徑為40～120 nm（圖1A，見封二）；NTA 檢測結果顯示，分離純化的外泌體直徑多集中于（84±5）nm（86%±3%）之間，這與TEM觀察的微粒大小相近（圖1B，見封二）。免疫印跡檢測結果顯示，胎盤外泌體標志性蛋白CD63、TSG101、PLAP 表達均呈陽性（圖1C，見封二）。

圖1 胎盤外泌體的鑒定。A：透射電鏡觀察母體血清中胎盤外泌體呈典型的杯狀或雙凹狀形態，標尺=100 nm，右上角插圖的標尺=10 nm；B：NTA 檢測分離純化的胎盤外泌體的粒徑大小及密度分布；C：免疫印跡檢測胎盤外泌體標志性蛋白CD63、TSG101、PLAP 的表達.

2.3 胎盤外泌體的攝取

PKH67（綠色熒光）標記的胎盤外泌體與DAPI 染核（藍色熒光）的HTR8 細胞共培養24 h 后，激光共聚焦顯微鏡觀察可見，PKH67 標記的外泌體能夠進入HTR8 細胞中，即胎盤外泌體能夠被滋養細胞HTR8 細胞所攝取（圖2，見封二）。

圖2 滋養細胞HTR8 細胞攝取胎盤外泌體，標尺=20 μm，白色箭頭指示外泌體.

2.4 胎盤外泌體對滋養細胞增殖的影響

MTT 檢測結果顯示，NP-Exo 對HTR8 細胞增殖能力無明顯變化，而GDM-Exo 能夠顯著促進HTR8 細胞增殖能力，且GDM-Exo 的濃度越高，HTR8 細胞的增殖能力越強。與對照組相比，GDM-10 μg Exo 組及GDM-20 μg Exo 組滋養細胞在GDM-Exo 處理24 h 后，細胞的增殖活性顯著增強，差異均有統計學意義（P<0.05），NP-10 μg Exo 組、NP-20 μg Exo 組滋養細胞的增殖活性無明顯變化（P>0.05）；與NP-10 μg Exo 組或NP-20 μg Exo 組相比，GDM-10 μg Exo 組與GDM-20 μg Exo組的滋養細胞增殖能力顯著增強（P<0.05）（圖3，見封二）。

圖3 GDM胎盤外泌體促進滋養細胞的增殖能力。*P<0.05 vs 對照組；#P<0.05 vs Np-10 μg Exo 組或Np-20 μg Exo 組.

2.5 胎盤外泌體對滋養細胞的細胞周期影響

流式細胞周期檢測結果顯示，NP-Exo對HTR8細胞的細胞周期無明顯影響，而GDM-Exo能明顯促進HTR8細胞的細胞周期進展，即處于G1期的細胞比例顯著減少，S期細胞明顯增加，且GDMExo 的濃度越高對HTR8細胞的細胞周期進展的促進作用越強。與對照組相比，GDM-10 μg Exo組及GDM-20 μg Exo組的滋養細胞處于G1期的細胞比例顯著降低，S期的細胞比例顯著增加，差異均有統計學意義（P<0.05），NP-10 μg Exo組、NP-20 μg Exo組無明顯變化（P>0.05）；與NP-10 μg Exo組或NP-20 μg Exo組相比，GDM-10 μg Exo組及GDM-20 μg Exo組的滋養細胞周期進展顯著增加（P<0.05）（圖4，見封二）。

圖4 GDM胎盤外泌體促進滋養細胞的細胞周期進展。A：對照組；B：NP-10 μg Exo 組；C：NP-20 μg Exo 組；D：GDM-10 μg Exo 組；E：GDM-20 μg Exo 組；F：不同細胞周期的細胞比例。*P<0.05 vs 對照組；#P<0.05 vs NP-10 μg Exo 組或Np-20 μg Exo 組.

2.6 胎盤外泌體對滋養細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI凋亡實驗結果顯示，NPExo對HTR8細胞凋亡率無明顯影響，而GDM-Exo明顯抑制HTR8細胞的凋亡，且GDM-Exo 的濃度越高對HTR8細胞的凋亡抑制率越強。與對照組相比，GDM-10 μg Exo組及GDM-20 μg Exo組滋養細胞在GDM-Exo處理24 h后，細胞的凋亡率明顯降低，差異均有統計學意義（P<0.05），NP-10 μg Exo組、NP-20 μg Exo組滋養細胞無明顯變化（P>0.05）；與NP-10 μg Exo組或NP-20 μg Exo組相比，GDM-10 μg Exo組及GDM-20 μg Exo組的滋養細胞凋亡率均顯著降低（P<0.05）（圖5，見封二）。

圖5 GDM胎盤外泌體抑制滋養細胞發生凋亡。A：對照組；B：NP-10 μg Exo 組；C：NP-20 μg Exo 組；D：GDM-10 μg Exo 組；E：GDM-20 μg Exo 組；F：各組HTR8細胞的凋亡率. *P<0.05 vs 對照組；#P<0.05 vs NP-10 μg Exo 組或NP-20 μg Exo 組.

3 討論

GDM 是指在妊娠后首次發現或發生糖代謝異常的疾病，其一般發生在妊娠的中晚期，是一種常見的妊娠合并癥。根據流行病學研究顯示，GDM在我國的發病率增加了2.8 倍（1999年為2.4%，2008年為6.8%）[15]，而2017年國內GDM 多中心研究顯示其發病率已高達12.2%[16]。GDM 嚴重影響母嬰健康，大量研究數據顯示，GDM 不僅增加胎兒并發癥，如巨大兒、新生兒低血糖、高膽紅素血癥等的發生率，還增加孕婦慢性高血壓、心血管疾病以及2 型糖尿病的發病率[17]。外泌體自1983年被Harding 等[18]發現以來，其作為細胞間重要信號轉導的重要載體已被人們廣泛重視。外泌體直徑為30～150 nm，內含豐富蛋白質、脂質、RNA 等生物活性物質，其主要標志物為CD63、TSG101、CD81 等[6]。胎盤組織作為高度特異化器官，其來源的外泌體不僅表達上述外泌體標志性蛋白，同時還表達PLAP，后者是鑒定外泌體來源于胎盤組織的重要標志分子之一。

既往研究表明，胎盤外泌體對維持正常的妊娠及胚胎的發育起著關鍵作用，如在妊娠相關的免疫耐受中顯示，胎盤外泌體能夠通過表達具有生物活性的死亡信使Fas配體與TRAIL，從而觸發細胞凋亡來介導母胎間免疫耐受[19]；Miranda等[20]報道胎盤外泌體在母體血漿中的表達量反映了胚胎的生長情況。同時，與正常發育的胎兒相比，胎兒宮內生長受限的胎盤外泌體分泌顯著減少。在子癇前期的研究中證實，子癇前期患者胎盤外泌體能夠通過高表達miR-155抑制血管內皮細胞釋放具有舒張血管作用的內皮型一氧化氮合酶，從而導致血管收縮，最終誘發子癇前期的產生[21]。研究顯示，與正常妊娠女性相比，GDM患者在孕早、中、晚期胎盤外泌體的濃度分別為1.6倍、1.5倍及1.3倍[6]，提示胎盤外泌體可能參與調節GDM的發生和發展。

滋養細胞是胎盤組織的主要成分，其正常功能對胎盤的形成和妊娠的維持具有重要作用[22]。既往在對GDM 相關研究中表明，GDM 患者胎盤中滋養細胞的增殖活力顯著增加，而細胞凋亡減少，細胞周期相關蛋白表達增加，導致胎盤組織生長較大，進而引起胎兒過度發育，新生兒體質量增加[12，23]。本研究結果顯示，與正常妊娠的胎盤外泌體相比，GDM 外泌體能夠顯著促進滋養細胞的增殖、細胞周期進展，并抑制其發生凋亡，且外泌體濃度越高，其對上述滋養細胞的作用越大。提示妊娠期糖尿病中胎盤外泌體可能通過促進滋養細胞的增殖、細胞周期進展，抑制其發生凋亡等作用參與妊娠期糖尿病發生和發展，為外泌體在妊娠期糖尿病中的應用奠定了基礎。