嬰幼兒乳粉中二十碳四烯酸和二十二碳六烯酸的測量不確定度評定

張方圓，王李平，潘云山，朱大林，李雪瑩

（廣東省科學院 廣東省測試分析研究所（中國廣州分析測試中心）廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室 廣東省保健食品功效成分檢測與風險物質快速篩查工程技術研究中心，廣州510070）

0 引言

二十碳四烯酸（arachidonic acid,ARA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA）是人體必需的不飽和脂肪酸，在嬰幼兒的生長發育中有重要作用，參與腦細胞的形成和發育，提升嬰幼兒的智力發育水平和視力敏銳度[1]。目前，主要采用GB 5009.168-2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》[2]來測定嬰幼兒食品中ARA和DHA含量。

測量不確定度是表征測量結果準確度的參數，是衡量檢測結果質量的重要指標[3-4]。通過對不確定度的分析和評定，可以找出影響檢測結果的關鍵步驟，從而提高檢測結果的準確性[5-7]。本文采用GB 5009.168-2016第一法測定了嬰幼兒乳粉中ARA和DHA的含量，并按照《CNAS-GL006:2019分析化學中不確定度的評估指南》[8]建立測量過程的數學模型，分析不確定來源，評定測定結果的標準不確定度和擴展不確定度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

十一碳甘油三酯，NU-CHEK PREP,INC；混合脂肪酸甲酯標準品40項，NU-CHEK PREP,INC；無水乙醇（色譜純），廣州化學試劑廠；乙醚（色譜純），廣州化學試劑廠；石油醚Ⅰ（色譜純），廣州化學試劑廠；甲醇（色譜純），廣州化學試劑廠；正庚烷（色譜純），廣州化學試劑廠；三氟化硼甲醇溶液(濃度為14%），上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent GC 7820A氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；HP-88色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25μm），美國安捷倫科技有限公司；Sartorius BT125D電子天平，賽多利斯工業稱重設備（北京）有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；0XW-80A旋渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗原理

依據GB 5009.168-2016《食品安全國家標準食品中脂肪酸的測定》第一法內標法測定嬰幼兒乳粉中ARA和DHA含量。該方法的原理如下：加入內標物的試樣經水解-乙醚溶液提取其中的脂肪后，在堿性條件下皂化和甲酯化，生成脂肪酸甲酯，經氣相色譜分析，內標法定量測定脂肪酸甲酯的含量。依據ARA和DHA甲酯含量和轉換系數計算出ARA和DHA的含量。

1.3.2 標準工作溶液的制備

脂肪酸甲酯混合標準溶液：準確稱取脂肪酸甲酯混標0.16476 g用正庚烷定容于25.0 mL容量瓶(A級)中，制成質量濃度6.524 mg/mL的混合標準溶液（共分為50個均量單位，每個單位為0.1305 mg/mL）。

十一烷酸甘油三酯內標溶液：準確稱十一碳酸甘油三酯標準品0.08234 g用甲醇定容于50.0 mL容量瓶(A級)中，制成1.630 mg/mL的十一碳酸甘油三酯內標溶液。

1.3.3 樣品的處理

試樣的稱取：準確稱取均勻試樣1 g(精確至0.0001 g)，于250 mL容量瓶中，準確加入2.0 mL十一烷酸甘油三酯內標溶液。加入約100 mg焦性沒食子酸，加入幾粒沸石，再加入2 mL 95%乙醇和4 m L水，混勻。

試樣的水解：采用酸水解法：加入鹽酸溶液10 mL，混勻。將燒瓶放入80℃水浴中水解40 min。每隔10 min振蕩一下燒瓶，使黏附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中。水解完成后，取出燒瓶冷卻至室溫。

脂肪提取：水解后的試樣，加入10 mL 95%乙醇，混勻。將燒瓶中的水解液轉移到分液漏斗中，用50 mL乙醚石油醚混合液沖洗燒瓶和塞子，沖洗液并入分液漏斗中，加蓋。振搖5 min，靜置10 min。將醚層提取液收集到250 mL燒瓶中。按以上步驟重復提取水解液3次，最后用乙醚石油醚混合液沖洗分液漏斗，并收集到250 mL燒瓶中。旋轉蒸發儀濃縮至干，殘留物為脂肪提取物。

脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化：在脂肪提取物中加入2%氫氧化鈉甲醇溶液8 mL，連接回流冷凝器，80℃水浴上回流，直至油滴消失。從冷凝器上端加入7 mL三氟化硼甲醇溶液，在80℃水浴中繼續回流2 min。用少量水沖洗冷凝器。停止加入，從水浴上取下燒瓶，迅速冷卻至室溫。準確加入25 mL正庚烷，振搖2 min，再加入飽和氯化鈉水溶液，靜置分層。吸取上層正庚烷提取溶液大約5 mL，至25 mL試管中，加入大約3～5 g無水硫酸鈉，振搖1 min，靜置5 min，吸取上層溶液到進樣瓶中待測定。

1.3.4 色譜條件

載氣：氮氣，流速：0.8 mL/min；空氣：450 mL/min；氫氣：40 m L/min；升溫程序：100℃保持2 min，以10℃/min速率升溫至150℃，再以2℃/min速率升溫至220℃，保持3 min，再以10℃/min速率升溫至230℃，保持1 min；進樣口溫度：250℃；檢測器溫度：270℃；進樣方式：分流進樣，分流比為10∶1；進樣量：1μL。

1.4 ARA、DHA含量計算

嬰幼兒乳粉中ARA、DHA含量的計算公式為：

式中：Xi為試樣中脂肪酸甲酯i的質量分數(mg/100g)；Fi為脂肪酸甲酯i的響應因子；Ai為試樣中脂肪酸甲酯i的峰面積；AC11為試樣中加入的內標物十一碳酸甲酯峰面積；CC11為十一碳酸甘油三酯質量濃度(mg/mL)；VC11為試樣中加入十一碳甘油三酯體積(mL)；1.0067為十一碳酸甘油三酯轉化成十一碳酸甲酯的轉換系數；FFAME-FA為脂肪酸甲酯轉化成脂肪酸的轉換系數，ARA為0.9560，DHA為0.9590；m為試樣的質量(g)。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

按照數學模型和測量方法，分析其不確定度來源有：響應因子Fi測定產生的不確定度；樣品稱量m所引入的不確定度；十一碳酸甘油三酯內標溶液濃度C11產生的不確定度；十一碳酸甘油三酯加入體積V11帶來的不確定度；樣品重復測量產生的不確定度以及氣相色譜儀器定量誤差產生的不確定度。

2.2 響應因子Fi的不確定度分析

取混合脂肪酸甲酯標準溶液，按上述色譜條件連續進樣6針，根據十一碳酸甲酯、ARA甲酯、DHA甲酯的濃度和峰面積計算響應因子。

響應因子Fi的計算公式為

式中：Fi為脂肪酸甲酯i的響應因子；CSi為混標中各脂肪酸甲酯i的質量濃度(mg/mL)；A11為試十一碳酸甲酯峰面積；Ai為脂肪酸甲酯i的峰面積；C11為混標中十一碳酸甲酯的質量濃度(mg/mL)。因此，Fi的相對不確定度urel（Fi）由以下3個分量合成：混合標準溶液中十一碳酸甲酯引入的相對標準不確定度urel（IS11），混合標準溶液中ARA甲酯和DHA甲酯引入的相對標準不確定度urel（Si），以及測定過程中引入的測量不確定度urel（Fi）。

2.2.1 混合標準溶液中十一碳酸甲酯的不確定度分析

準確稱取脂肪酸甲酯混標0.16476 g用正庚烷定容于25.0 mL容量瓶(A級)中，制成6.524 mg/mL的混合標準溶液（共分為50個均量單位，每個單位為0.1305mg/mL）。

2.2.1.1 標準品純度

脂肪酸甲酯混標純度＞99%，可認為其最大允許誤差為1.0%。按均勻分布處理，標準品純度引入的標準不確定度為：u(p11)=0.01/=0.00577%，相對標準不確定度為：urel(p11)=0.00577/0.99=0.00583。

2.2.1.2 標準品稱量

稱取標準品164.76 mg，所使用的天平，其示值誤差測量結果的擴展不確定度為0.03 mg(k=2)，重復性偏差為0.02 mg(由檢定證書提供)。前者的標準不確定度為0.03/2=0.015 mg；后者為0.02/1.96=0.0102 mg(取95%置信水平，k=1.96)。在稱重時應重復計算兩次不確定度(一次為清零時，另一次為最后讀數時)。因此標準品稱量mstd標準不確定度和相對標準不確定度分別為u(mstd)==0.0257 mg；urel(mstd)==0.000156。

2.2.1.3 標準溶液配制與稀釋過程的相關體積

混合標準溶液的配置中使用25 mL容量瓶定容。根據JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[9]規定，20℃時25 mL容量瓶(A級)的容量允差為±0.03 mL，取矩形分布，則標準不確定度為=0.017 mL；對典型25 mL容量瓶充滿10次并稱量的實驗，得標準偏差為0.028 mL，即為標準不確定度；容量瓶在20℃校準，本測試是在25℃的條件下進行的，容量瓶和溶液溫度與校準時不同所引起的體積變化為±25 m L×5℃×1.24×10-3℃-1=0.000155 mL(1.24×10-3℃-1為正庚烷的體積膨脹系數)，取矩形分布，則溫度對體積的影響所引入的標準不確定度為0.0000895 mL。溫度效應引入的不確定度遠小于校準和重復性的不確定度,因此在以下的評定中忽略溫度的影響。則，25 mL容量瓶體積Vflask引入的標準不確定度為u(Vflask)==0.0329 mL；相對標準不確定度為urel(Vflask)==0.00132。

由于混合標準溶液的配置中僅使用25 mL容量瓶定容，因此標準溶液配制與稀釋過程的相關體積Vstd引起的相對標準不確定度urel(Vstd)=urel(Vflask)=0.00132。

綜上所述：混合標準溶液中十一碳酸甲酯濃度引入的不確定度為

2.2.2 混合標準溶液中ARA甲酯、DHA甲酯的不確定度分析

準確稱取脂肪酸甲酯混標0.16476 g用正庚烷定容于25.0 mL容量瓶(A級)中，制成質量濃度為6.524 mg/m L的混合標準溶液（共分為50個均量單位，每個單位為0.1305 mg/mL）。

2.2.2.1 標準品純度

脂肪酸甲酯混標純度＞99%，可認為其最大允許誤差為1.0%。按均勻分布處理，標準品純度引入的標準不確定度為u(p11)=0.01/=0.00577%相對標準不確定度為urel(p11)=0.00577/0.99=0.00583。

2.2.2.2 標準品稱量

稱取標準品164.76 mg，所使用的天平，其示值誤差測量結果的擴展不確定度為0.03 mg(k=2)，重復性偏差為0.02 mg(由檢定證書提供)。前者的標準不確定度為0.03/2=0.015 mg；后者為0.02/1.96=0.0102 mg(取95%置信水平，k=1.96)。在稱重時應重復計算兩次不確定度(一次為清零時，另一次為最后讀數時)。因此標準品稱量mstd標準不確定度和相對標準不確定度分別為u(mstd)=)=0.0257 mg；urel(mstd)==0.000156。

2.2.2.3 校準標準溶液配制與稀釋過程的相關體積

混合標準溶液的配置中使用25 m L容量瓶定容，由2.2.1.3可知，25 mL容量瓶體積引入的標準不確定度為u(Vflask)==0.0329 mL；相對標準不確定度為urel(Vflask)==0.00132。

由于混合標準溶液的配置中僅使用25 mL容量瓶定容，因此標準溶液配制與稀釋過程的相關體積Vstd引起的相對標準不確定度urel(Vstd)=urel(Vflask)=0.00132。

綜上所述：混合標準溶液中ARA甲酯和DHA甲酯濃度引入的不確定度均為

2.2.3 響應因子Fi的測量不確定度

6次測定的ARA甲酯響應因子分別為0.9156，0.9088，0.9142，0.9028，0.9186，0.9074；DHA甲酯響應因子分別為0.9027，0.8995，0.9013，0.8889，0.8978，0.8948。標準不確定度采用平均值的標準偏差(n=6)，分別為

因此，響應因子測定產生的相對標準不確定度分別為

2.3 樣品稱量m的不確定度分析

稱樣1 g，天平檢定證書提供的示值誤差測量結果的擴展不確定度為0.3 mg(k=2)，重復性偏差為0.1 mg(由檢定證書提供)。前者的標準不確定度為0.3/2=0.15 mg；后者為0.1/1.96=0.0510 mg(取95%置信水平，k=1.96)。在稱重時應重復計算兩次不確定度(一次為清零時，另一次為最后讀數時)。其標準不確定度和相對標準不確定度分別為

2.4 十一碳酸甘油三酯內標溶液濃度C 11的不確定度

準確稱十一碳酸甘油三酯標準品0.08234 g用甲醇定容于50.0 mL容量瓶(A級)中，制成質量濃度為1.630 mg/mL的十一碳酸甘油三酯內標溶液。

2.4.1 標準品純度

十一碳酸甘油三酯標準品純度＞99%，可認為其最大允許誤差為1.0%。按均勻分布處理，標準品純度引入的標準不確定度為：u(p11)=0.01/=0.00577%相對標準不確定度為uret(p11)=0.00577/0.99=0.00583。

2.4.2 標準品稱量

稱取標準品82.34 mg，所使用的天平，其示值誤差測量結果的擴展不確定度為0.03 mg(k=2)，重復性偏差為0.02 mg(由檢定證書提供)。前者的標準不確定度為0.03/2=0.015 mg；后者為0.02/1.96=0.0102 mg(取95%置信水平，k=1.96)。在稱重時應重復計算兩次不確定度(一次為清零時，另一次為最后讀數時)。因此標準品稱量m11標準不確定度和相對標準不確定度分別

2.4.3 校準標準溶液配制與稀釋過程的相關體積

內標溶液的配制中使用50 mL容量瓶定容。根據JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[9]規定，20℃時50 mL容量瓶(A級)的容量允差為±0.05 mL，取矩形分布，則標準不確定度為0.029 mL；對典型50 mL容量瓶充滿10次并稱量的實驗，得標準偏差為0.053 mL，即標準不確定度；容量瓶在20℃校準，本測試是在25℃的條件下進行的，容量瓶和溶液溫度與校準時不同所引起的體積變化為±50 m L×5℃×1.10×10-3℃-1=0.00275 mL(1.10×10-3℃-1為正己烷的體積膨脹系數)，取矩形分布，則溫度對體積的影響所引入的標準不確定度為0.00159 mL。溫度效應引入的不確定度遠小于校準和重復性的不確定度,因此在以下的評定中忽略溫度的影響。則，50 m L容量瓶體積Vflask50引入的標準不確定度和相對標準不確定度分別為

由于十一碳酸甘油三酯內標溶液的配置中僅使用50 mL容量瓶定容，因此十一碳酸甘油三酯內標溶液配置過程的相關體積V11引起的相對標準不確定度urel(V11)=urel(Vflask50)=0.00121。

綜上所述：十一碳酸甘油三酯內標溶液濃度引入的不確定度：

2.5 十一碳酸甘油三酯內標溶液加入體積V的不確定度分析

實驗中，使用2.0 mL分度吸量管準確加入內標2.0 mL。根據JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規程》規定[9]，20℃時0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，25.0 mL分度吸量管的容量允差、分布、標準不確定度計算如表1。

表1 流出式分度吸量管（A級）的標準不確定度

分別對典型0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，25.0 mL分度吸量管充滿10次并稱量的實驗，得標準偏差分別為0.0025，0.005，0.008，0.0125，0.0200，0.0500 mL，即標準不確定度。因此2.0 mL分度吸量管合成標準不確定度和相對標準不確定度分別為=0.0106 mL；=0.0053。因此，十一碳酸甘油三酯內標溶液加入體積V引入的相對標準不確定度為urel(V)=0.0053。

2.6 樣品重復測量產生的不確定度

制樣過程產生的不確定度采用6次樣品測定結果的相關數據進行計算。ARA質量分數6次的測定結果為：48.3、49.6、48.9、49.0、49.2、47.5 mg/100 g，平均質量分數為=48.7 mg/100g，標準偏差為SARA=0.73 mg/100 g。DHA質量分數6次的測定結果為：27.4、27.9、27.3、27.9、28.0、27.1 mg/100 g，平均質量分數為xDHA=27.6 mg/100 g，標準偏差為SDHA=0.35 mg/100 g。重復測量產生的標準不確定度和其相對標準不確定度分別為：

2.7 GC量校準

由儀器校準證書知，GC定量的允差是3%，取矩形分布，則相對不確定度為：urel(Q)=。

2.8 合成不確定度和擴展不確定度

嬰幼兒乳粉中ARA和DHA質量分數測定的不確定度分量如表2所示。

表2 嬰幼兒乳粉中ARA和DHA質量分數測定的不確定度分量

因各分量相互獨立不相關，因此樣品中ARA和DHA測定結果的相對合成不確定度為

ARA的質量分數為：XARA=xARA=48.7 mg/100 g；DHA的質量分數為：XDHA=xDHA=27.6 mg/100g。則標準合成不確定度為：

不確定度各分量按正態分布處理，取包含因子k=2，置信水平P為95%，所以擴展不確定度為

因此，本次測定的嬰幼兒乳粉樣品中ARA的質量分數為CARA=(48.7±2.2)mg/100 g（k=2，P=95%）；DHA的質量分數為CDHA=(27.6±1.2)mg/100 g（k=2，P=95%）。

3 結 論

本文按照《CNAS-GL006:2019分析化學中不確定度的評估指南》對GB 5009.168-2016第一法測定嬰幼兒乳粉中ARA和DHA質量分數的不確定度進行評價。通過對不確定度評定和來源分析可知，本次測定的不確定來源主要為氣相色譜儀的定量誤差及重復性引入的不確定度。因此，在實驗過程中增加平行測定次數，嚴格按照標準方法，規范操作，并對檢測儀器進行必要的維護，確保儀器的穩定狀態，能夠有效降低實驗結果的不確定度，提高實驗結果的準確性和實驗室的檢測質量。