伊維菌素納米乳中伊維菌素含量HPLC檢測方法的建立

苗 艷，朱慶賀，陳 曦，楊旭東，王 爽，王麗坤，陳 亮，蘭世捷，馮萬宇，李 丹，史同瑞

(黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江齊齊哈爾161005)

伊維菌素(Ivermectin，IVM)具有廣譜、高效、安全等優點，是一種使用廣泛的抗寄生蟲藥物，對動物體內外寄生蟲，尤其是線蟲和節肢動物，具有高效驅殺作用[1-2]。由于伊維菌素幾乎不溶于水，明顯制約了伊維菌素的應用范圍，尤其在制備伊維菌素注射劑型時，溶解伊維菌素需要大量使用有機溶劑，不僅增加了生產成本，也增大了對動物的刺激性[3]。伊維菌素由于其高效驅殺皮膚寄生蟲的作用，常被用于制備抗牛羊寄生蟲的透皮藥物，但普通的透皮劑型效果不佳。為克服伊維菌素注射及透皮劑型的缺點，本研究室制備了高含水量的伊維菌素納米乳劑，為水包油型乳劑，不僅降低了企業生產成本以及對動物的刺激性，而且已有研究表明，納米乳劑能顯著增加藥物的透皮效果[4]，這為獸醫臨床中伊維菌素的應用提供了可選擇的新劑型。由于自制伊維菌素納米乳劑的進一步研究需要，本研究建立了納米乳劑中伊維菌素的高效液相色譜含量檢測方法，從而為自制伊維菌素納米乳劑的穩定性考察以及含量檢測提供技術支持。

1 材料與儀器

1.1 材料 伊維菌素標準品，含量92.0%，中國食品藥品檢定研究院；伊維菌素，含量95.7%，河北美荷藥業有限公司；伊維菌素納米乳劑樣品(自制)，規格為1%伊維菌素納米乳劑；乙腈/甲醇均為色譜純，賽默飛世爾科技公司。

1.2 儀器 高效液相色譜儀，LC-20AT，日本島津公司；二級管陣列檢測器，SPD-M20A，日本島津公司； InertSustain C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，島津技邇(上海)商貿有限公司；純水儀，XYE2-20-H型，北京湘順源科技有限公司；電子分析天平，MS104TS/02型，梅特勒-托利多(上海)有限公司；實驗室pH計，FE20型，梅特勒-托利多(上海)有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相： 甲醇：乙腈：水(40∶55∶5)；檢測波長254 nm；流速：1 mL/min；注溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取經干燥至恒重的伊維菌素對照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成92.0 μg/mL的對照品儲備液。精密量取1 mL對照品儲備液，置于10 mL容量瓶中，容量瓶中加入流動相稀釋至刻度，搖勻，0.45 μM微孔濾膜過濾，制備為濃度為9.20 μg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 按照配方比例制備伊維菌素納米乳劑，精密取樣品適量(相當于伊維菌素10 mg)，置100 mL 容量瓶中，加流動相充分溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 mL置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μM微孔濾膜過濾，制備為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液制備 按配方比例量取與供試品相當的空白納米乳劑(不含伊維菌素，其他成分與伊維菌素納米乳劑相同)適量，按照2.2.2項下供試品溶液的制備方法制備為陰性對照溶液。

2.3 系統適用性和專屬性試驗 分別取伊維菌素對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按2.1項色譜條件測定，結果見圖1。在該色譜條件下，伊維菌素H2B1b和H2B1a峰保留時間分別為7.1和8.1 min左右，陰性對照在此時間附近未出峰，因此,對伊維菌素HPLC的測定沒有影響，專屬性能滿足檢測要求。

圖1 HPLC 色譜圖

2.4 線性試驗 精密量取對照品儲備液0.5、1.0、3.0、8.0、10 mL分別置于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，配置成濃度分別為4.6、9.2、27.6、73.9、92.0 μg/mL的系列對照品溶液。按2.1項下色譜條件測定，以B1a和B1b峰面積總和(y)對伊維菌素的濃度(x，μg/mL)進行線性回歸，方程為y=15285x+12584，r2=0.9996。結果表明伊維菌素在4.6～92.0 μg/mL范圍內線性關系良好(圖2)。

圖2 伊維菌素標準曲線

2.5 回收率測定 取適量伊維菌素對照品并添加配方劑量的空白納米乳劑基質，超聲溶解后用流動相稀釋為高(110.4 μg/mL)、中(92.0 μg/mL)、低(73.6 μg/mL)3 種理論濃度的對照品，每個濃度配制 3 份，按2.1項下色譜條件測定其含量，計算回收率，結果見表1。結果表明高、中、低濃度對照品的平均回收率為98.25%～98.76%。該方法回收率符合要求。

表1 伊維菌素的回收率(n=3)

回收率R% = 實測濃度/理論濃度 × 100%

2.6 精密度的測定 取批號20191030的伊維菌素納米乳劑樣品適量(約相當于伊維菌素10 mg)，精密稱定，按高、中、低三個濃度水平分別添加伊維菌素原料試藥，制備為向已知含量制劑中添加已知測定物的添加樣品，每個濃度水平的添加樣品分別制備3份供試品。按2.2.2項制成供試品溶液，進行含量測定，計算精密度，結果見表2。結果表明高、中、低濃度供試品回收率為97.25%～100.14%，精密度良好，RSD小于2%。

表2 精密度試驗結果

2.7 檢測限(LOD)和定量限(LOQ)測定 取伊維菌素儲備液分別配制為0.046、0.092、0.184、0.368 μg/mL濃度的檢測溶液，按2.1項下色譜條件后過微孔濾膜進樣測定，測得基線噪音值，以10倍信噪比(S/N>10)所對應的伊維菌素濃度為最低定量限，確定本方法定量限為0.092 μg/mL。以3倍信號強度與噪聲強度的比值(S/N>3)所對應的伊維菌素濃度為檢出限，確定本方法檢出限為0.046 μg/mL。

2.8 樣品含量測定 精密量取3批次的伊維菌素納米乳劑樣品，每批次3份，按2.2.2項制備為供試品溶液，進行含量測定。結果表明，批號為20191001、20191115、20191131的3批樣品中伊維菌素平均含量分別為標示量的98.37%、99.68%、100.04%，符合規定。

3 結 論

紫外吸收峰值檢測結果表明，伊維菌素在244 nm附近有最大吸收。但對比檢測色譜圖發現，244 nm液相色譜圖雜峰對伊維菌素的主峰稍有干擾，而254 nm色譜圖則分離良好。此外，參考獸藥典2015版要求，伊維菌素應在254 nm處進行檢測，所以本研究建立的納米乳中伊維菌素含量檢測方法選擇254 nm進行檢測。通過色譜結果的比較分析，在254 nm波長下測定，能夠獲得最大的靈敏度和抗干擾能力。

本實驗室前期研發了伊維菌素微乳劑型[4]，為了更好的改良劑型，繼續研發了伊維菌素納米乳劑。納米乳與微乳是近年來研究的熱點載藥劑型，兩種劑型都是由油相、水相、表面活性劑以及助表面活性劑按照一定比例制備而成的粒徑在100～1000 nm范圍內的外觀澄清透明的劑型[5]，但與微乳不同的是，納米乳的制備需要借助外來能量(如機械攪拌或組分的化學能)才能形成穩定的體系[6]。納米乳劑最早在農藥相關制品中被應用，由于其水溶性好、穩定性好，最大限度的發揮了除草劑、殺蟲劑以及一些殺菌劑的殺滅能力[7]。在中藥揮發油領域中納米乳劑也被廣泛應用[8]，研究表明，將揮發油類藥物制備為納米乳劑，可以改善配方的穩定性，增強藥物與細胞或受體的相互作用，增強靶向性，提高生物利用度，改善藥物對粘膜、皮膚的通透性，減少藥物對組織的刺激性，并有效保護揮發油的揮發和降解。近年來，納米乳劑也有在抗生素中作為載藥體系應用的報道，尤其對于難溶于水的藥物，如由乙酰甲喹、利福昔明、氟苯尼考等藥物制備的納米乳劑[9-11]，研究表明乙酰甲喹納米乳劑制品安全性良好，納米乳劑能顯著增加乙酰甲喹的透皮效果，并且相對生物利用度能達到乙酰甲喹溶液制劑的694.45%[9]。另外由于納米乳劑具有無限溶于水，在水中分散良好的優點，研究人員研制了水產用伊維菌素納米乳劑，解決了水產用乳油劑殺蟲劑的局限[12-13]。在局部用藥中納米乳劑也有較為廣泛的應用[6]，佛司可林納米乳劑被研制成為透皮制劑，透皮效果顯著[14]。

綜合納米乳劑的劑型優勢以及獸醫臨床使用的需要，本實驗室研發了獸用伊維菌素納米乳劑，為更好的對新劑型藥物的穩定性考察及含量檢測，建立了納米乳劑中伊維菌素的HPLC含量檢測方法。本方法分離度好，伊維菌素H2B1b和H2B1a峰保留時間分別為7.1和8.1 min左右，峰形好，基本無拖尾，雜質不干擾實驗測定，而且采用外標法測定伊維菌素納米乳劑的含量操作簡單，結果準確，回收率高，重復性好，是伊維菌素納米乳劑中伊維菌素含量檢測的簡便、快速、準確的方法。