HPLC法測定芪藍囊病飲中的靛玉紅

牛華星，章安源，趙 見, 郭 騰，李有志，尹伶靈，劉少寧，陳 玲，魏秀麗，張志民，張傳津*

(1.山東省獸藥質量檢驗所，濟南 250022；2.日照市東港區濤雒計生委,日照 276800)

芪藍囊病飲是收載于《獸藥質量標準》2017卷的純中藥制劑[1]，主要成分為黃芪、板藍根、大青葉、地黃、赤芍，具有提高疫苗免疫應答效果(參考說明書的功能主治)。目前本制劑標準只是對黃芪、板藍根、大青葉進行定性薄層鑒別，缺少對有效成份定量控制。有文獻表明[2-3]，靛玉紅(indirubin)是大青葉、板藍根的主要指標成分，因此本文主要開展了反相高效液相色譜法測定靛玉紅方法學研究，為完善芪藍囊病飲的質量標準提供依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥 Waters e-2695(配二極管陣列檢測器2998)；靛玉紅對照品(批號：110717-200204)(中國藥品生物檢定所)；乙腈(色譜純)；磷酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；水為超純水；供試品：芪藍囊病飲口服液(某公司提供，批號：202006271，202006281，202006291，202007271，202007281，202007291)，陰性空白制劑自制；其他試劑均為分析純。

1.2 方法與結果

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相A：乙腈；流動相B：0.2%磷酸水溶液；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。檢測波長為289 nm，梯度洗脫條件見表1；

表1 梯度洗脫條件

1.2.2 溶液的制備 取13.58 mg靛玉紅對照品，精密稱定，加三氯甲烷配制成1358 μg/mL的對照品儲備液。取1 mL儲備液用甲醇制成67.9 μg/mL標準工作液，依次倍比稀釋成系列濃度：2.0、1.5、1.0、0.8、0.6、0.5 μg/mL標準工作液。

取1 mL供試品溶液于50 mL，離心管中，加入9 ml三氯甲烷，振搖1 min，靜置分層棄去上清液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。另取不含大青葉的陰性空白制劑，同法制成陰性空白對照溶液。

1.2.3 專屬性試驗 分別吸取10 μL“1.2.2”項下陰性空白對照溶液、供試品溶液、對照品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。在靛玉紅對照品相應色譜峰位置處無其他色譜峰出現(圖1)。

圖1 陰性供試品溶液(A)供試品溶液(B)靛玉紅對照品溶液(C)

1.2.4線性關系考察 分別吸取“1.2.2”項下標準曲線工作液，在“1.2.1”項色譜條件下，使用梯度洗脫方法，可以有效分離目標峰，靛玉紅在0.5～2.0 μg/mL范圍內呈良好的線性關系(圖2)。

圖2 靛玉紅溶液的標準曲線

1.2.5 重復性與穩定性 精密量取同批供試品1 mL,按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，注入液相色譜儀，進樣10 μL，記錄色譜圖，靛玉紅峰面積RSD為 1.4 %。說明樣品重復性良好。

將其中一份供試品溶液，取10 μL分別于放置后2、5、7、12 h注入液相色譜儀，記錄色譜圖，靛玉紅峰面積RSD為1.4%。結果表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

1.2.6 精密度試驗 取“1.2.2”項下靛玉紅對照品溶液，注入液相色譜儀，進樣10 μL，連續進樣6次，記錄色譜圖，靛玉紅峰面積RSD為0.4 %。結果表明，儀器精密度良好。

1.2.7 加樣回收實驗 精密量取已知含量的樣品1 mL，精密加入10.1850 μg/mL的靛玉紅對照品0.5 mL，制備陽性添加供試品6份。按“1.2.2”項下方法供試品溶液，進樣10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算加樣回收率計算加樣回收率(表2)。回收率在89.2%～92.4%之間，RSD為1.34%。表明該方法回收率好，準確度滿足檢測要求。

表2 加樣回收率試驗結果(μg/mL，n=6)

1.2.8 樣品的測定 精密量取6批芪藍囊病飲進行測定。分別吸取供試品溶液和對照品溶液各10 μL，按“1.2.1”項下色譜條件，外標法計算含量。結果測定6批芪藍囊病飲中靛玉紅的含量(表3)。

1.2.9 不同儀器相同色譜條件下樣品檢測比較 使用waters e2695和agilent高效液相色譜儀，按“1.2.1”項下色譜條件運行，對出峰時間和含量進行比較(表3)，結果表明:芪藍囊病飲中靛玉紅的平均含量，相對偏差1.52%。結果表明，該方法在不同儀器上，檢測結果穩定。

表3 不同儀器相同色譜條件結果表(μg/mL，n=6)

2 討論與結論

2.1 指標成分的選取[4-6]板藍根、大青葉是芪藍囊病飲的主要藥成分。板藍根別名靛青根、藍靛根、靛根，是十字花科菘藍屬植物菘藍的干燥根，含有靛玉紅、吲哚苷、多種氨基酸、β-古甾醇、植物性蛋白、糖類等成分。大青葉是十字花科菘藍屬植物菘藍的干燥葉，含有靛玉紅、靛藍、菘藍苷B、扶桑甾醇、芥苷類多種成分。其中靛玉紅為板藍根、大青葉中含量較高的主要成分，化學研究表明靛玉紅可作為藥材和其制劑的質量控制指標。大青葉中另一含量較高的成分為靛藍，靛藍與靛玉紅為同分異構體，靛藍分子中的氫鍵小于靛玉紅，其性質不穩定，不耐光和熱。本文只選擇靛玉紅作為指標成分進行實驗。

2.2 提取溶劑的選擇 根據文獻相關方法[7-9]，實驗比較了甲醇，乙醚，氯仿，二甲基甲酰胺等溶劑的提取效果。采用“1.2.1”色譜條件進樣，比較峰面積值，結果顯示，甲醇提取效果較差，二甲基甲酰胺提取效果較好，靛玉紅在乙醚，氯仿中提取效果最好，因乙醚對c18色譜柱有一定損害，最終選擇氯仿為供試品提取溶劑。

2.3 提取方式選擇 實驗比較了不同提取方式對制劑中靛玉紅提取效率的影響。精密量取芪藍囊病飲供試品1 mL于玻璃試管中，加入9 mL氯仿，分別采取，振搖，超聲。采用“1.2.1”色譜條件進樣，比較峰面積值，結果顯示，振搖，超聲的提取效率基本一致。為方便實驗操作，選擇振搖作為本方法測試藥物的提取方式。

2.4 流動相的選擇 根據文獻相關方法[10-11]，大青葉，青黛和小兒清咽顆粒中靛玉紅的采用不同比例的甲醇水或乙腈水為流動相分別測定，在此基礎上探討對比不同的流動相及流動相比例，對芪藍囊病飲中的靛玉紅進行測定。選用甲醇-水(75∶25，V∶V),(80∶20，V∶V)；甲醇-1%醋酸(50∶50，V∶V)，乙腈-水(53∶47，V∶V)四種流動相，比較色譜圖，結果發現乙腈-水(53∶47，V∶V)，靛玉紅的峰形較好，但是仍與供試品溶液其他成分峰不易分離。本實驗最終將流動相優化為乙腈-0.2%磷酸水，并進行梯度洗脫，發現供試品中靛玉紅與其他成分分離較好。在waters e2695(PDA)與Agilent1260 infinityⅡ(PDA)上，多次進樣，專屬性好，滿足實驗要求。

2.5 影響含量測定的因素 影響芪藍囊病飲中靛玉紅的含量差異因素很多，原料藥材產地、采收期、投料和加工工藝，都會使靛玉紅的含量有所差異。所以，對制劑中有效成分進行定量控制非常必要。

研究建立了HPLC法測定芪藍囊病飲中靛玉紅的含量，經方法學驗證，該方法前處理簡單，色譜分離較好，可為完善芪藍囊病飲的質量標準提供依據。