一株重組類NADC30豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及基因組分析

楊 康，袁林茂，張維達，李自力*

(1.農業微生物學國家重點實驗室，華中農業大學動物醫學院，湖北省預防獸醫學重點實驗室，武漢430070；2.上海新農飼料股份有限公司，上海201600)

豬繁殖與呼吸綜合征俗稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起豬繁殖障礙和呼吸系統損傷的高度接觸性傳染病，病豬和帶毒豬是主要傳染源[1]。該病最早于1987年在美國被報道，隨后在許多國家出現。PRRSV分為兩個基因型，即以LV為代表的歐洲型和以VR2332為代表的美洲型[2-3]。1996年，郭寶清等[4]在中國首次分離到PRRSV CH-1a株。2006年，田克恭等[5]首次報道中國暴發高熱病，后確定是由高致病性PRRSV(Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，HP-PRRSV)所致，其Nsp2基因存在30(1+29)個氨基酸的不連續缺失(相對于CH-1a)，這是判斷HP-PRRSV的重要分子特征。2008年，在美國報道了一株 Nsp2 基因存在131個不連續氨基酸缺失的PRRSV，命名為NADC30[6]。2013年，周峰等[7]對河南省豬繁殖與呼吸綜合征進行了流行病學調查，發現了與美國NADC30同源性較高的毒株，由于這類毒株與NADC30親緣關系較近，國內現將該類病毒統稱為類NADC30 PRRSV(NADC30-like PRRSV)。目前我國大部分省份均有類NADC30株檢出，且陽性率逐年上升，類NADC30株現已成為多地的優勢毒株。

PRRSV具有變異快的特點，特別是其非結構蛋白Nsp2、結構蛋白GP5變異最大，已有許多依據Nsp2及ORF5作為PRRSV遺傳進化及基因分型的相關報道[8-9]。Shi等[10]對全球8624份PRRSV ORF5基因序列進行分析，將北美型PRRSV分為9個譜系(lineage1～9)。目前我國PRRSV分為4個譜系：lineage 1、lineage 3、lineage 5.1和lineage 8。也有國內學者根據Nsp2序列的差異，將我國PRRSV分為經典PRRSV、HP-PRRSV、類NADC30 PRRSV、疫苗毒株等。

目前商品化的疫苗主要針對經典PRRSV和HP-PRRSV。Bai等[11]建立了類NADC30 PRRSV的攻毒模型，評價了幾種最主要的商品化疫苗的保護效力，證明現有疫苗不能對類 NADC30 PRRSV提供完全保護。因此，類NADC30株的分離工作意義重大。本研究旨在分離類NADC30株并分析其分子遺傳進化特點，從而為上海地區的豬繁殖與呼吸綜合征防控提供參考，為進一步研究其重組機制、致病特點及研制預防類NADC30 PRRSV疫苗等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 2份疑似豬繁殖與呼吸綜合征肺臟病料采自上海某豬場發病豬；E.coliDH5α感受態細胞由華中農業大學湖北省預防獸醫學重點實驗室制備并保存；HP-PRRSV(XJ株)由華中農業大學湖北省預防獸醫學重點實驗室分離并保存；pMD18-T克隆載體購自大連寶生物有限公司；胎牛血清購自Gbico公司；DMEM培養基購自Hyclone公司；高保真DNA聚合酶(Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase，P505-d1)、反轉錄試劑盒(R223-01)購自南京諾唯贊生物科技有限公司；FITC標記羊抗鼠IgG購自ABclonal 公司；抗PRRSV GP5的單克隆抗體(MAb)由華中農業大學動科動醫學院李建惠贈。

1.2 引物設計與合成 依照周峰[7]設計鑒別引物的原理，參考經典PRRSV CH-1a(AF132118)、HP-PRRSV JXA1(EF112445)、NADC30 PRRSV(MH500766)Nsp2基因序列，使用SnapGene設計Nsp2特異性鑒別引物(上游引物：5’-TGATTGGAATGTTGTGCTTCCTGGG-3，下游引物：5’-TGTCAAGCGTGAGAATCACACGCCC-3’)，可擴增出經典PRRSV(1047 bp)、HP-PRRSV(957 bp)、類NADC30 PRRSV(654 bp)；根據NADC30(MH500766)的基因組序列設計10對重疊基因片段引物(表1)，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 全基因擴增引物

1.3 豬肺泡巨噬細胞(PAMs)的獲取 參照孟春花等[12]所采用的方法制備并保存豬肺泡巨噬細胞。

1.4 病料處理和RT-PCR檢測 將1 g肺組織剪碎加入裝有適量PBS的離心管中，加入鋼珠后將離心管置于組織破碎儀中充分破碎，離心取上清后參照張維達等[13]報道的方法提取總RNA。按反轉錄試劑盒說明書將總RNA反轉錄為cDNA。PCR反應條件為95 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min、35個循環；最后72 ℃ 10 min。取適量PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 病毒的分離、鑒定及純化 將步驟1.4中經RT-PCR檢測呈陽性的樣品接種于鋪滿單層PAMs的6孔細胞培養板內。細胞培養板置于37 ℃ 5% CO2培養3～5 d。接種后每天觀察細胞狀態，盲傳3代后收集細胞培養物經RT-PCR鑒定。經RT-PCR檢測為陽性的細胞上清接種PAMs，培養48 h后，用4%甲醛室溫固定30 min，0.1%Triton X-100室溫穿透15 min，使用1∶200稀釋抗PRRSV-GP5單克隆抗體于37 ℃孵育1 h，再用1∶500稀釋FITC標記羊抗鼠 IgG 37 ℃孵育1 h，同時設正常細胞作為對照，經IFA鑒定。

按照王培培所采用的方法[14]進行病毒噬斑純化。使用PAMs擴繁病毒，將收獲的病毒液經超濾濃縮，蔗糖密度梯度離心后經透射電鏡檢測。

1.6 分離株的基因組擴增、克隆和測序 將分離株按照步驟1.4的操作提總RNA，經RT-PCR分段擴增，PCR產物純化回收后連接到pMD18-T載體，轉化，經PCR鑒定為陽性的重組質粒由上海生物工程股份有限公司測序。

1.7 基因序列同源性以及遺傳進化分析 利用軟件SeqMan(version 7.1.0)對測序結果進行重疊片段序列拼接，采用軟件MegAlign(version 7.1.0)和MEGA(version 6.0)對分離株全基因組序列與GenBank登錄的國內外毒株全基因組序列進行同源性和遺傳進化分析，同時對分離株Nsp2與GP5氨基酸序列進行同源性及遺傳進化分析，利用軟件SimPlot(version 3.5.1) [200 bp window sliding along the genome alignment (20-bp step size)]對分離株全基因組序列和參考株基因序列進行重組分析。

1.8 分離株對Marc-145細胞的嗜性分析 將分離株接種Marc-145細胞，每天觀察細胞狀態，接種48～72 h后經RT-PCR檢測PRRSV核酸，同時經IFA檢測PRRSV GP5，將收獲的細胞上清傳代培養3次，評價分離株的細胞嗜性。

2 結果與分析

2.1 臨床樣品的檢測 以患病豬肺臟RNA為模板，針對PRRSV Nsp2基因的鑒別引物進行RT-PCR，結果顯示1號肺樣為弱陽性，2號肺樣為強陽性，且擴增條帶為654 bp，陽性對照擴增出957 bp條帶(圖1)。將2號肺樣的PCR產物送測序，經BLAST序列比對，發現樣品中病毒和NADC30的部分Nsp2基因的同源性較高。

M：DL2000 Marker；1：1號肺樣；2：陰性對照；3：2號肺樣；4：陽性對照(XJ，HP-PRRSV)

2.2 病毒的分離鑒定 將檢測為陽性的樣品經0.22 μm濾器過濾后接種PAMs，在PAMs中連續傳代3代后可出現穩定且典型的細胞病變(CPE)，使用臺盼藍對接種72 h的細胞培養物染色，經普通光學顯微鏡觀察，可見細胞脫落、破碎(圖2B)。使用鼠抗PRRSV GP5單克隆抗體和FITC標記羊抗鼠IgG對感染48 h的PAMs進行間接免疫熒光鑒定，經熒光顯微鏡觀察，可見接種陽性樣品的PAMs呈現綠色熒光，為抗原陽性反應(圖2D)。

將噬斑純化后擴大培養并儲存，將制備好的病毒樣品經透射電鏡觀察，可見直徑為50 nm左右的圓形顆粒(圖2E)。以上實驗數據表明成功分離出一株PRRSV，將其命名為SH2019。

2.3 PRRSV的全基因組擴增，同源性及遺傳進化分析

2.3.1 PRRSV的全基因組擴增 將病毒約為15 kb的全基因組序列按參考株NADC30分為10個重疊基因片段，使用10對引物進行RT-PCR擴增，擴增結果如下所示(圖3)，序列拼接結果顯示SH2019的全基因組大小為14677 bp(不含5'UTR和3'UTR)。

M：DL2000 Marker；A～J：單個基因片段；N：陰性對照

2.3.2 分離株全基因組的同源性分析及遺傳進化分析 將拼接完的全基因組序列與GenBank登錄的參考毒株序列進行同源性分析和遺傳進化分析。同源性比對結果顯示，分離株SH2019與歐洲型代表株LV的同源性為60.5%，與北美型PRRSV的同源性在82.5%～91.3%，與NADC30的同源性最高，為91.3%。遺傳進化樹分析結果顯示，SH2019與中國本土類NADC30株HENAN-XINX、CHsx1401有很近的親緣關系，這些分離株歸屬在流行于中國大陸的北美型PRRSV譜系1中(圖4A和4B)。上述結果表明，分離株SH2019屬于類NADC30 PRRSV。

分離株用▲標注(the isolate was marked with ▲)

2.4 分離株Nsp2、ORF5基因編碼的氨基酸序列分析

2.4.1 分離株Nsp2基因編碼氨基酸序列的不連續缺失分析 氨基酸序列比對結果顯示，分離株SH2019相對于經典毒株(CH-1a)在Nsp2中存在NADC30特征性的131(111+1+19)個氨基酸缺失(圖5)。

分離株用＿標注(the isolate was marked with＿)

2.4.2 分離株Nsp2、ORF5基因編碼氨基酸序列的同源性及遺傳進化分析 根據Nsp2、GP5氨基酸序列同源性比對結果，分離株SH2019與歐洲代表株LV的Nsp2氨基酸序列同源性僅為49.8%，但與NADC30的同源性最高，為89.9%；分離株SH2019與歐洲型代表株LV的GP5氨基酸序列同源性最低，為54.6%，與NADC30的同源性最高，為89.4%。Nsp2、GP5氨基酸序列的遺傳進化分析結果顯示，分離株SH2019與中國本土類NADC30株HENAN-XINX、CHsx1401及北美株NADC30屬于同一個譜系(圖6)。上述結果進一步證實，分離株SH2019屬于類NADC30 PRRSV。

分離株用▲標注(the isolate was marked with ▲)

2.5 分離株的基因組重組分析 以分離株SH2019全基因組序列為查詢序列，根據軟件Simplot分析結果，發現全基因組有3個重組斷點(12601 nt、12761 nt、12901 nt)，將分離株SH2019全基因組分為4個片段(圖7A)。片段1～12600 nt和片段12902～14677 nt與NADC30的同源性最高，分別為91.0%和93.4%；片段12601～12761 nt與QYYZ的同源性最高，為91.3%；片段12762～12901 nt與BJ-4或JXA1的同源性最高，均為94.2%。進一步將4個基因片段分別制作遺傳進化樹，結果見圖7B。由試驗數據可知，分離株SH2019是以譜系1(代表株NADC30)的毒株為主要親本，以譜系3(代表株QYYZ)、譜系5(代表株VR2332、BJ-4)或譜系8(代表株JXA1)的毒株為次要親本，在12601～12901 nt(ORF2～ORF4)發生了基因重組。上述結果表明，分離株SH2019是發生基因重組的類NADC30 PRRSV。

與分離株SH2019處于同一譜系的毒株均標注▲

2.6 分離株對Marc-145細胞的嗜性分析 將分離株SH2019接種Marc-145細胞48～72 h后，光學顯微鏡觀察細胞是否出現CPE，同時經RT-PCR、IFA檢測分離株能否感染Marc-145細胞。結果顯示，并未觀察到明顯的CPE，RT-PCR、IFA檢測也均為陰性，傳3代每代檢測都為陰性。第3代細胞培養物的IFA檢測結果見圖8。上述結果表明，分離株SH2019對Marc-145細胞無嗜性。

圖8 分離株對Marc-145細胞的嗜性分析(100×)

3 結論與討論

自2013年首次發現類NADC30 PRRSV以來[7]，這類毒株便在我國迅速流行，對我國養豬業造成了較大的經濟損失。由于現階段商品化疫苗僅能對類NADC30 PRRSV提供部分保護力[11]，因此分離類NADC30 PRRSV具有一定應用價值，可為以后研制相關疫苗奠定基礎。

本研究最初采用Marc-45細胞分離PRRSV，將經RT-PCR檢測為陽性的臨床樣品接種Marc-145細胞后，鏡檢未發現CPE，細胞培養物經RT-PCR檢測也呈陰性，因此改用PAMs分離病毒。張洪亮等[15]報道的15株類NADC30 PRRSV中有13株病毒只能感染PAMs而不能感染Marc-145細胞；阮海宇等[16]用Marc-145細胞對類NADC30 PRRSV嘗試進行分離，發現該毒株在Marc-145上適應性不好，不能直接用Marc-145分離該病毒。由于很多類NADC30株不能在Marc-145細胞中復制，而PAMs的獲取成本較高，所以研制預防類NADC30株的疫苗具有較大難度。由此構建對類NADC30株高敏感性的細胞系可為疫苗的研制提供一條路徑。

類NADC30株較經典PRRSV和HP-PRRSV具有更高的重組概率，目前很多類NADC30株以NADC30為主要親本，以譜系3、5、8中的毒株為次要親本，在不確定的基因組位置發生重組。例如Liu等[17]分離的類NADC30株(FJLIUY-2017)是以NADC30為主要親本，以類VR2332株(12013 ～13282 nt)、類QYYZ株(13857 ～15140 nt)、類JXA1株(1～709 nt、1274～1829 nt、6890～9528 nt及11806～11524 nt)為次要親本進行基因重組的毒株。目前關于類NADC30株發生重組的具體機制尚無準確認知，重組病毒的生物學特性可能會發生改變，越來越多重組毒株的出現給我國豬繁殖與呼吸綜合征的防控和凈化帶來了巨大的挑戰。

Zhang等[18]通過反向遺傳學技術證明類NADC30株(MY-376，只能感染PAMs，而不能感染Marc-145細胞)的次要結構蛋白GP2a、GP3決定了其對Marc-145細胞的嗜性。目前一般認為PRRSV入侵細胞包含以下幾步：首先PRRSV顆粒的異源二聚體(GP5/M)通過和胞膜上的硫酸乙酰肝素(pHS)互作而聚集在細胞表面，但是該作用較弱，接著唾液酸黏附素(pSn)與GP5/M相互結合強化第一步的吸附作用，并在網格蛋白介導的內吞作用下，病毒-受體復合物內化進入胞內體，并且這種配體-受體的互作十分依賴于pSn的唾液酸結合能力。隨后病毒顆粒的次要結構蛋白復合物(GP2a/GP3/GP4)與必需受體pCD163互作并在胞內體酶的酸性條件下介導PRRSV脫衣殼和基因組釋放，其中GP2a 184位天冬酰胺的N-糖基化對互作起了關鍵的作用[19]，其他受體(vimentin、CD151、DC-SIGN)也在PRRSV侵入過程中發揮了一定作用。對分離株SH2019 GP2a糖基化位點預測，發現其同樣具有GP2a 184位天冬酰胺的N-糖基化現象，由此推測不太可能是GP2a與CD163互作的改變而影響分離株的細胞嗜性。由于分離株在ORF2～ORF4的基因組位置上和類QYYZ、類VR2332或類JXA1株發生了重組，推測可能是基因重組導致了分離株SH2019不能感染Marc-145細胞，但是還需要進一步研究來解釋該現象。也有實驗室通過構建穩定表達PAMs CD163(pCD163)的Marc-145細胞系，發現與野生型細胞相比，Marc-145pCD163可成功感染類NADC30株(SD17-38)，且經過多次重復驗證，該毒株并不能在野生型Marc-145細胞中成功復制[20]。由于Marc-145細胞與PAMs均表達CD163蛋白，這提示不同物種間CD163蛋白的差異性也可能與類NADC30株的細胞嗜性有關。

本研究分離鑒定了一株重組類NADC30 PRRSV，豐富了類NADC30株的信息，可為上海地區豬繁殖與呼吸綜合征的臨床防控提供參考。