中藥制劑歸芎益母散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

吳雪琴, 孫 研,王勝義,王 磊,吳亮紅,岳 鵬,崔東安

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730050)

歸芎益母散是以中獸醫(yī)學(xué)理、法、方、藥為基礎(chǔ)，遵循君臣佐使原則，結(jié)合中藥研究，研制出的復(fù)方散劑，是由益母草、當(dāng)歸、川芎、紅花、香附和甘草[3]等中藥制成的散劑，益母草對(duì)子宮有雙向調(diào)節(jié)作用,可以降低產(chǎn)后子宮的TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物 (TIMP-1) 水平, 啟動(dòng)止血修復(fù)機(jī)制, 并加快細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 降解, 從而加速產(chǎn)后子宮修復(fù)[1-2]。當(dāng)歸、川芎和紅花是中獸醫(yī)經(jīng)典活血化瘀藥材,對(duì)子宮均有調(diào)節(jié)作用,可加速子宮內(nèi)殘留蛻膜及分泌物排出,促進(jìn)產(chǎn)后子宮修復(fù)[4-6]。甘草具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等多種作用[7]。其臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，功效主要有“活血化淤、行氣止痛”，主要用于奶牛產(chǎn)后惡露不行，胎衣不下，血瘀腹痛等癥[6]。

為探索歸芎益母散的質(zhì)量控制指標(biāo)及方法，采用薄層色譜法對(duì)歸芎益母散中的中藥成分進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法對(duì) “歸芎益母散”中的鹽酸水蘇堿進(jìn)行定量測(cè)定等多方面研究歸芎益母散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。從而保證該中獸藥復(fù)方制劑的產(chǎn)品質(zhì)量，使其在臨床安全有效使用，以此達(dá)到減少奶牛因胎衣不下而引發(fā)的各種相關(guān)疾病，提高奶制品質(zhì)量，促進(jìn)我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 蒸發(fā)光檢測(cè)器高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；點(diǎn)樣儀(SP-20E,上海科哲有限公司)；薄層色譜成像儀(Goodlook-1000,上海科哲有限公司)；微量分析天平(RADWAG Wagi Elektroniczne)；電子天平(AL104,梅特勒有限公司)；超聲波清洗器(昆山潔力美超聲儀器有限公司)；硅膠G板(200 mm×100 mm,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；電熱套(上海瑞茲儀器設(shè)備有限公司)。

1.1.2 藥品 歸芎益母散(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制)。鹽酸水蘇堿(批號(hào)：110712-201614，中國(guó)食品藥品檢定研究院)、益母草(120912-201209，中國(guó)食品藥品檢定研究院)當(dāng)歸(120927-201315，中國(guó)食品藥品檢定研究院)、川芎(120918-201411，中國(guó)食品藥品檢定研究院)、紅花(120907-201412，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

甲醇、乙腈為色譜純；丙酮、正己烷、乙醇、鹽酸、硫氰酸鉻銨、丙酮、硫酸銀、氯化鋇、冰醋酸等為分析純。

1.2 方法

1.2.1 定性鑒別

1.2.1.1 益母草的TCL 樣品溶液的制備：取歸芎益母散3.5 g置錐形瓶中，再加入50 mL無(wú)水乙醇，搖勻，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?.1 moL/mL鹽酸溶液10 mL使溶解，濾過，濾液加入新配制的雷氏銨鹽飽和溶液15 mL，4 ℃放冷1 h，濾過，沉淀加約20 mL水洗滌，濾過，加丙酮2 mL使溶解，作為供試品溶液。取其他批次的樣品做重復(fù)。

陰性對(duì)照溶液的制備：根據(jù)處方比例，去除益母草后，將各個(gè)藥按比例稱取，按照歸芎益母散樣品溶液處理方法，制成陰性對(duì)照溶液。

對(duì)照藥材溶液的制備：稱取對(duì)照藥材益母草1.0005 g置錐形瓶中，加10 mL無(wú)水乙醇，搖勻，同法制成對(duì)照藥材溶液。

對(duì)照品的制備：精密稱取對(duì)照品鹽酸水蘇堿10.0006 mg置5 mL容量瓶中，加甲醇定容，即為2.0003 mg/mL的對(duì)照品溶液。

測(cè)定方法：參照薄層色譜法(附錄43頁(yè))試驗(yàn)[8]，分別取10 μL陰性對(duì)照溶液、三批不同批次的樣品溶液，5 μL對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液，依次點(diǎn)于硅膠G板上，將丙酮：無(wú)水乙醇：鹽酸(10∶6∶1)混合液作為展開劑，展開，取出。于105 ℃加熱15 min，放冷后噴以稀碘化鉍鉀試液：三氯化鐵試液(10∶1)，晾干，日光下檢視。

1.2.1.2 當(dāng)歸、川芎的薄層鑒別 樣品溶液的制備：取歸芎益母散5 g置錐形瓶中，加正己烷50 mL，超聲處理30 min，過濾后，將濾液蒸干后，加1 ml正己烷溶解殘?jiān)礊闃悠啡芤骸Ｈ∑渌蔚臉悠纷鲋貜?fù)[8]。

陰性對(duì)照溶液的制備：根據(jù)處方比例，去除當(dāng)歸和川芎后，將各個(gè)藥按比例稱取，按照歸芎益母散樣品溶液處理方法，制成陰性對(duì)照溶液。

對(duì)照藥材溶液的制備：取當(dāng)歸對(duì)照藥材1 g，川芎對(duì)照藥材1 g，當(dāng)歸、川芎混合對(duì)照藥材1 g(當(dāng)歸對(duì)照藥材、川芎對(duì)照藥材各0.5 g)，按照歸芎益母散樣品溶液處理方法，制成對(duì)照藥材當(dāng)歸、川芎以及當(dāng)歸和川芎混合溶液。

方法測(cè)定：參照薄層色譜法(附錄43頁(yè))試驗(yàn)[8]，分別取3 μL陰性對(duì)照溶液、三批不同批次的樣品溶液，2 μl當(dāng)歸和川芎混合對(duì)照藥材溶液、當(dāng)歸對(duì)照藥材溶液、川芎對(duì)照藥材溶液，依次點(diǎn)于硅膠G板上，將石油醚(60～90 ℃)：乙酸乙酯(10∶0.4)作為展開劑，展開，取出后晾干，并置紫外燈(365 nm)檢視。

1.2.1.3 紅花的薄層鑒別 樣品溶液的制備：取歸芎益母散10.0000 g置錐形瓶中, 再加80%丙酮50 mL,搖勻后超聲處理15 min，過濾，蒸干濾液，加5 mL 80%丙酮溶解殘?jiān)鳛闃悠啡芤篬9-10]。取其他批次的樣品做重復(fù)。

陰性對(duì)照溶液的制備：根據(jù)處方比例，去除紅花后，將各個(gè)藥按比例稱取，按照歸芎益母散樣品溶液處理方法，制成陰性對(duì)照溶液。

對(duì)照藥材溶液的制備：稱取對(duì)照藥材紅花0.5003 g置錐形瓶中，加入5 mL 80%丙酮，搖勻后超聲處理15 min，靜置，取上清，作為對(duì)照藥材溶液。

方法測(cè)定：參照薄層色譜法(附錄43頁(yè))試驗(yàn)[8]，分別取10 uL陰性對(duì)照溶液、三批不同批次的樣品溶液, 5 μL對(duì)照藥材溶液，依次點(diǎn)于硅膠G薄層板上，將乙酸:乙酯丁酮:甲酸:水(5∶3∶1∶1)混合液作為展開劑，展開后，取出，晾干，日光下檢視。

1.2.2 歸芎益母散中鹽酸水蘇堿含量測(cè)定

1.2.2.1 溶液的制備 樣品溶液的制備：精密稱取歸芎益母散2.0002 g置圓底燒瓶中，加50 mL 70%乙醇后稱重，回流2 h，放冷，70%乙醇加足重量，離心，精密吸取上清液25 mL, 蒸干，用0.1 moL/mL稀鹽酸25 mL溶解，離心(3000轉(zhuǎn)/分) 10 min，傾出上清液，加少量0.1 moL/mL稀鹽酸洗滌沉淀，洗液合并入上清液，并加入新配制的2.5%硫氰酸鉻銨溶液20 mL，振搖，置冰浴(4 ℃)中3 h，離心(3000轉(zhuǎn)/分) 10 min，棄去上清液，沉淀用少量冰水洗滌后，棄去洗液，加2 mL丙酮使溶解。丙酮液中滴加0.5%硫酸銀溶液6 mL，離心(3000轉(zhuǎn)/分) 10 min，傾出上清液，沉淀用少量丙酮洗滌，合并洗液與上清液并滴加1%氯化鋇溶液2 mL，離心(3000 轉(zhuǎn)/分)10 min，傾出上清液，沉淀用70%乙醇洗滌，洗液加入上清液，蒸干，加適量70%乙醇使其殘?jiān)芙猓⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，定容，即得歸芎益母散樣品溶液。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取3.375 mg對(duì)照品鹽酸水蘇堿置10 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容，即得0.0375 mg/mL的鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液。

陰性對(duì)照液的制備：根據(jù)處方比例，去除益母草后，將各個(gè)藥按比例稱取，按照歸芎益母散樣品溶液處理方法，制成陰性對(duì)照溶液。

1.2.2.2 色譜條件 色譜柱：Venusil HILIC(250 mm×4.6 mm，5 um，天津博納艾杰爾科技有限公司)；乙腈:0.2%乙酸水溶液(83:17)；體積流量0.8 mL/min；蒸發(fā)光散射器；柱溫25 ℃；檢測(cè)器溫度50 ℃，霧化室溫度80 ℃；進(jìn)樣量10 uL。理論塔板數(shù)按鹽酸水蘇堿峰計(jì)算均不低于5000。

1.2.2.3 專屬性試驗(yàn) 分別吸取1.2.2.1中對(duì)照品鹽酸水蘇堿溶液、歸芎益母散樣品溶液、去除益母草的其他藥陰性對(duì)照液各10 μL進(jìn)樣，記錄色譜峰。

1.2.2.4 線性范圍考察 分別精密稱定鹽酸水蘇堿對(duì)照品8.115 mg置10 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成含鹽酸水蘇堿為0.8115 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋成含鹽酸水蘇堿0.115、0.40575、0.202875、0.1014375、0.05071875 mg/mL的系列溶液，精密吸取10 μL，按照上述色譜條件注入色譜儀，以測(cè)定峰面積對(duì)數(shù)對(duì)鹽酸水蘇堿濃度進(jìn)行回歸分析。

1.2.2.5 精密度試驗(yàn) 取鹽酸水蘇堿對(duì)照品濃度為0.285 mg/mL溶液，按2.1.2.2色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，并計(jì)算RSD。

1.2.2.6 日間穩(wěn)定性考察 取2.1.2.1中樣品溶液，按2.1.2.2色譜條件分別在0、4、8、12、24 h吸取該樣品溶液10 μL，進(jìn)樣、測(cè)定并記錄峰面積，并計(jì)算RSD。

1.2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定取同一批樣品6份2.0 g，按“樣品溶液制備”項(xiàng)下操作，按2.1.2.2色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算RSD。

1.2.2.8 準(zhǔn)確性試驗(yàn) 取已知含有量的樣品6份，精密稱定2 g，按樣品已知含量的100%加入鹽酸水蘇堿標(biāo)準(zhǔn)品1.116 mg/mL各加3.3 mL。按2.1.2.1 “樣品溶液制備”項(xiàng)下，按2.1.2.2色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積后計(jì)算加樣回收率，并計(jì)算RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性鑒別結(jié)果

2.1.1 益母草的薄層鑒別 益母草的定性鑒別結(jié)果見圖1，圖中，歸芎益母散樣品在與鹽酸水蘇堿對(duì)照品相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照樣品無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)，但陰性對(duì)照樣品與益母草對(duì)照藥材有相同顏色的斑點(diǎn)。參考女金丸、產(chǎn)康復(fù)顆粒、四物益母丸等制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中益母草的鑒別[9]，僅保留鹽酸水蘇堿對(duì)照品作為鑒別對(duì)照，方法具有專一性。

圖1 歸芎益母散中益母草的的TCL圖

2.1.2 當(dāng)歸、川芎的薄層鑒別 當(dāng)歸、川芎的薄層鑒別結(jié)果見圖2。圖中，歸芎益母散樣品在與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，顯示相同的顏色的熒光斑點(diǎn)。

圖2 歸芎益母散中當(dāng)歸、川芎的TCL

2.1.3 紅花的薄層鑒別 紅花的薄層鑒別結(jié)果見圖3。圖中，歸芎益母散樣品在與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，顯示相同的顏色的主斑點(diǎn)。陰性樣品無(wú)相應(yīng)的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，方法具有專一性。

圖3 歸芎益母散中紅花的TCL圖

2.2 歸芎益母散中鹽酸水蘇堿含量測(cè)定結(jié)果

2.2.1 專屬性試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果中，樣品中鹽酸水蘇堿峰型對(duì)稱度好，陰性樣品在鹽酸水蘇堿處無(wú)吸收，無(wú)干擾歸芎益母散的測(cè)定。理論塔板數(shù)按鹽酸水蘇堿計(jì)為9698。試驗(yàn)結(jié)果見圖4-圖6。

圖4 鹽酸水蘇堿對(duì)照品色譜圖

圖5 歸芎益母散供試品中中鹽酸水蘇堿色譜圖

圖6 陰性樣品中鹽酸水蘇堿色譜圖

2.2.2 線性范圍考察 以鹽酸水蘇堿對(duì)照品濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(x)，色譜峰面積對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸，得出回歸方程y=1.54x+0.5123，R2=0.9996，見圖7，結(jié)果表明，鹽酸水蘇堿濃度在0.0507～0.8115 mg范圍與峰面積對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系。

圖7 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3 精密度試驗(yàn) 計(jì)算RSD，RSD(n=6)為0.83%，表明本方法精密度良好，可以滿足含量測(cè)定要求。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 鹽酸水蘇堿精密度試驗(yàn)結(jié)果表

2.2.4 日間穩(wěn)定性試驗(yàn) 計(jì)算含量和RSD，RSD(n=6)為0.66%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 鹽酸水蘇堿日間穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 計(jì)算含量和RSD，RSD(n=6)分別為1.25%，表明樣品制備方法重復(fù)性良好。試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 鹽酸水蘇堿重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表

2.2.6 準(zhǔn)確性試驗(yàn) 計(jì)算回收率和RSD，樣品中鹽酸水蘇堿平均回收率(n=6)為107.15%，RSD為1.90%。試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 鹽酸水蘇堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果表

回收率計(jì)算公式為：

式中：A為樣品所含被測(cè)成分量，B為加入對(duì)照品量，C為實(shí)測(cè)量。

2.2.7 樣品測(cè)定試驗(yàn) 經(jīng)測(cè)定，三批鹽酸水蘇堿的平均含量分別為2.320 、2.294、2.201 mg/mL，RSD=2.75%，說明不同批號(hào)的川芎益母散中鹽酸水蘇堿的含量穩(wěn)定。

表5 樣品測(cè)定鹽酸水蘇堿試驗(yàn)結(jié)果表

3 討 論

益母草作為歸芎益母散中的君藥，其鹽酸水蘇堿含是衡量歸芎益母散制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)性成分，對(duì)鹽酸水蘇堿使用ELSD法進(jìn)行定量研究，且結(jié)果表明此法測(cè)定歸芎益母散中的鹽酸水蘇堿專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、精密度高，且陰性無(wú)干擾。對(duì)君藥益母草和輔藥川芎、當(dāng)歸和紅花進(jìn)行TCL研究，結(jié)果表明歸芎益母散樣品在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上，顯示相同的顏色的主斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)相應(yīng)的斑點(diǎn)，TLC鑒別方法斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。因此通過對(duì)歸芎益母散中益母草、川芎、當(dāng)歸和紅花的定性鑒別及鹽酸水蘇堿的含量測(cè)定，能夠有效控制歸芎益母散質(zhì)量。

在歸芎益母散中益母草的TCL研究中，色譜方法參照2015版《中國(guó)藥典》一部1006頁(yè)[11]，陰性對(duì)照樣品與益母草對(duì)照藥材色譜圖中有相同顏色的斑點(diǎn)，但與對(duì)照品鹽酸水蘇堿無(wú)對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)，參考藥典中女金丸、產(chǎn)康復(fù)顆粒、四物益母丸等制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中益母草的鑒別[12]，僅保留鹽酸水蘇堿對(duì)照品作為鑒別對(duì)照。

在紅花TLC 鑒別方法中，將歸芎益母散樣品及對(duì)照藥材紅花提取液蒸干時(shí)，使用減壓濃縮法至干，不可水浴蒸干。

在測(cè)定歸芎益母散中鹽酸水蘇堿含量時(shí)，制備供試品過程中：加20 mL2.5%硫氰酸鉻銨溶液后，冰浴(4 ℃)時(shí)間越久，測(cè)定含量呈上升趨勢(shì)，3 h為最佳，因此冰浴時(shí)間為3 h。在加1%氯化鋇溶液前濃縮為1 mL與不濃縮均對(duì)測(cè)定鹽酸水蘇堿含量結(jié)果無(wú)明顯差異，因此在實(shí)驗(yàn)中在加1%氯化鋇溶液前不濃縮。

4 結(jié) 論

研究建立的君藥益母草、輔藥川芎、當(dāng)歸和紅花進(jìn)行TLC鑒別陰性對(duì)照無(wú)干擾、斑點(diǎn)清晰且專屬性較強(qiáng)。益母草中鹽酸水蘇堿的含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便易行，重現(xiàn)性較好，為控制和評(píng)價(jià)歸芎益母散的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。