沉默EpCAM表達(dá)對(duì)膽囊癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

鄔仲鑫 蔡煒龍 尹磊

膽囊癌起源于膽道上皮細(xì)胞，是膽道系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1-2]，在我國(guó)其發(fā)病率逐年增加。由于膽囊癌早期缺乏明顯和特殊的臨床癥狀，且易轉(zhuǎn)移，因此大多數(shù)患者明確診斷時(shí)已處于腫瘤中晚期。目前，根治性切除是膽囊癌唯一有效的治療方法，但其根治性（R0）切除率低[3]。膽囊癌對(duì)放化療效果不顯著，尚無(wú)有效的靶向治療或免疫治療方案，因此預(yù)后極差，患者平均生存時(shí)間只有5.2～24.4個(gè)月，且近年來(lái)，膽囊癌患者的5年相對(duì)生存率持續(xù)下降[4]。因此，目前亟待了解膽囊癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機(jī)制并研制出針對(duì)性較強(qiáng)的分子靶向治療藥物[5]。上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）是一種分子量為40 kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其通過(guò)參與細(xì)胞核信號(hào)傳導(dǎo)、介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移、增殖和分化等過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。大量研究表明，EpCAM在結(jié)腸癌、肺癌、胃癌等腫瘤中呈高表達(dá)[6]，且抗EpCAM靶向藥物已用于治療惡性腹腔積液[7]。然而有關(guān)EpCAM在膽囊癌中的作用研究很少，因此本研究探討沉默EpCAM表達(dá)對(duì)膽囊癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人膽囊癌細(xì)胞株（EH-GB1、EH-GB2、GBC-SD、NOZ、OCUG-1、SGC-996）由中國(guó)科學(xué)院上海生命研究院細(xì)胞資源中心提供。DMEM培養(yǎng)基、William′s培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基和FBS均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；鏈霉素-青霉素雙抗購(gòu)自上海翊圣有限公司；小干擾RNA si-NC和si-EpCAM（5′-CUAC AAGCUGGCCGUAAACdTdT-3′）、EpCAM引物均由上海拓然生物科技有限公司合成；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；CCK-8試劑盒、多聚甲醛、結(jié)晶紫均購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自大連Takara公司；酶標(biāo)儀（BIORAD，IMARK）購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；顯微鏡（OLYMPUS，cx23）購(gòu)自中國(guó)奧林巴斯有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人膽囊癌細(xì)胞株置于5%CO2和37℃的培養(yǎng)箱中，分別用含10%FBS和100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。EH-GB1、EH-GB2、GBC-SD和OCUG-1細(xì)胞株使用DMEM培養(yǎng)基，NOZ細(xì)胞株使用William培養(yǎng)基，SGC-996細(xì)胞株使用RPMI1640培養(yǎng)基。細(xì)胞常規(guī)置于100 mm培養(yǎng)皿中，于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)使用胰蛋白酶-EDTA消化并收集。

1.3 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 將人膽囊癌細(xì)胞株NOZ和GBC-SD分為實(shí)驗(yàn)組（si-EpCAM組）、對(duì)照組（si-NC組）和空白組（Control組），其中si-EpCAM組細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-EpCAM，si-NC組細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC，Control組細(xì)胞不添加小干擾RNA。將NOZ和GBC-SD細(xì)胞株接種于6孔板內(nèi)，待長(zhǎng)至30%～50%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過(guò)程按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，即用250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)液分別稀釋10 μl 20 μmol/L的siRNA儲(chǔ)存液和5 μl lipo2000，混勻并室溫孵育5 min后將兩者混合，室溫孵育20 min，加入到含有1 500 μl Opti-MEM培養(yǎng)基的6孔板內(nèi)。轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基。待48 h后收集人膽囊癌細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 EpCAM的mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用qRTPCR法。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中加入1 ml Trizol提取總RNA，檢測(cè)RNA的濃度和純度。按mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s；60℃退火延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：上游：5′-AATCGTCAATGCCAGTGTACTT-3′；下游：5′-TCTCATCGCAGTCAGGATCATAA-3′。其相對(duì)表達(dá)量采用 2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8法。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞常規(guī)消化、離心、重懸后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接種于96孔板中，GBC-SD 細(xì)胞每孔 0.8×103個(gè)，NOZ 細(xì)胞每孔 1×103個(gè)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中，分別于1、2、3、4 d加入培養(yǎng)液與CCK-8按9∶1 混合的反應(yīng)液 100 μl/孔，37 ℃避光培養(yǎng) 3～4 h 后取出，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度（OD）值來(lái)表示細(xì)胞增殖能力，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 細(xì)胞克隆能力檢測(cè) 采用克隆形成實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞常規(guī)胰酶消化、離心、重懸后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞分別接種于3 cm培養(yǎng)皿中，每孔1 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中。持續(xù)2周，定期換液隨時(shí)檢查，到細(xì)胞形成克隆時(shí)終止培養(yǎng)，染色觀察克隆數(shù)量。每孔加入1 ml 4%多聚甲醛固定后以結(jié)晶紫染色。拍照并采用Image J軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞常規(guī)胰酶消化、離心、重懸后計(jì)數(shù)。用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/ml。取200 μl細(xì)胞懸液加于上層小室，下室加入500 μl 10%FBS的完全培養(yǎng)基，放置在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24～48 h后取出Transwell小室，去除小室上清液，用PBS沖洗，多聚甲醛固定20 min后，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，結(jié)晶紫染色20 min，PBS沖洗。顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野的細(xì)胞遷移數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 6株及3組細(xì)胞EpCAM的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 6株細(xì)胞中，NOZ和GBC-SD細(xì)胞株EpCAM的mRNA相對(duì)表達(dá)量相對(duì)較高，SGC-996細(xì)胞株最低，見(jiàn)圖1；而在NOZ和GBC-SD細(xì)胞株中，si-EpCAM組Ep－CAM的mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于si-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 3組NOZ和GBC-SD細(xì)胞EpCAM的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

圖1 6株膽囊癌細(xì)胞EpCAM的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（EpCAM為上皮細(xì)胞黏附分子）

2.2 3組細(xì)胞增殖能力比較 加入CCK-8后第4天，NOZ和GBC-SD細(xì)胞株中，與si-NC組比較，si-EpCAM組細(xì)胞OD值均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)圖 2。

圖2 3組NOZ和GBC-SD細(xì)胞增殖能力比較（OD為吸光度；*P＜0.05）

2.3 3組NOZ和GBC-SD細(xì)胞克隆能力比較 NOZ和GBC-SD細(xì)胞株中，si-EpCAM組細(xì)胞的克隆形成數(shù)均明顯少于si-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)圖3（插頁(yè)）、表2。

圖3 3組NOZ和GBC-SD細(xì)胞克隆能力比較（EpCAM為上皮細(xì)胞黏附分子）

表2 3組NOZ和GBC-SD細(xì)胞克隆形成數(shù)比較

2.4 3組NOZ和GBC-SD細(xì)胞遷移能力比較 NOZ和GBC-SD細(xì)胞株中，與si-NC組比較，si-EpCAM組中細(xì)胞遷移數(shù)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)圖4（插頁(yè)）、表3。

圖4 3組NOZ和GBC-SD細(xì)胞遷移能力比較（EpCAM為上皮細(xì)胞黏附分子；結(jié)晶紫染色，×100）

表3 3組NOZ和GBC-SD細(xì)胞遷移數(shù)比較

3 討論

膽囊癌惡性程度較高，病程進(jìn)展迅速，缺乏有效治療手段，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)。近幾十年來(lái)關(guān)于膽囊癌的研究有了一定的進(jìn)展，但早期診斷和采取合適的治療方法仍是改善本病預(yù)后的主要途徑。然而，膽囊癌高轉(zhuǎn)移、高侵襲特性的分子機(jī)制尚未被完全闡明，并且用于膽囊癌診斷的腫瘤分子標(biāo)志物特異性較差，遠(yuǎn)不能為膽囊癌的早期診斷提供分子靶標(biāo)。

EpCAM最早于1979年在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)，是一種嗜同種非鈣離子依賴(lài)性上皮細(xì)胞黏附分子。除了在細(xì)胞間黏附中發(fā)揮作用外，相關(guān)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)還表明，EpCAM在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，增殖及分化中起著重要作用[8]。EpCAM在上皮起源的腫瘤中有著異常的高表達(dá)水平，在結(jié)直腸癌、肝癌等多種腫瘤中作為篩選腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物[9-10]；也可作為在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中治療和預(yù)后的標(biāo)志物[11-12]。EpCAM的預(yù)后價(jià)值在不同腫瘤中有所差別，在乳腺癌[13]、結(jié)直腸癌[14]、前列腺癌[15]、胰腺癌[16]等中，高表達(dá)和預(yù)后不良呈正相關(guān)；而在食管癌[17]、胃癌[18]、甲狀腺癌[19]等中，高表達(dá)和預(yù)后不良呈負(fù)相關(guān)。因此，EpCAM與不同臨床結(jié)果之間的關(guān)系是復(fù)雜的，可能與腫瘤的起源或腫瘤進(jìn)展的階段相關(guān)，其相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

Varga等[20]發(fā)現(xiàn)，EpCAM高表達(dá)是膽囊癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究初步探討了EpCAM在膽囊癌細(xì)胞NOZ和GBC-SD中對(duì)其增殖和轉(zhuǎn)移功能的影響，為今后進(jìn)一步的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。EpCAM作為上皮細(xì)胞黏附分子，在細(xì)胞間連接和癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用。本研究首先在6株膽囊癌細(xì)胞系中檢測(cè)了EpCAM的mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NOZ和GBC-SD中EpCAM的相對(duì)表達(dá)量較高，可能與NOZ和GBC-SD本身具有較強(qiáng)的遷移能力相關(guān)；而在SGC-996中，EpCAM幾乎沒(méi)有表達(dá)，也提示可能與SGC-996較弱的遷移能力有關(guān)（關(guān)于膽囊癌細(xì)胞的遷移能力數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）。在Transwell實(shí)驗(yàn)中，敲減EpCAM的表達(dá)明顯抑制了NOZ和GBC-SD的遷移能力，證明了EpCAM的確在膽囊癌細(xì)胞的遷移中發(fā)揮了重要作用，其相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，在膽囊癌中是否與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)也有待探索。此外，本研究應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了敲減EpCAM的表達(dá)可抑制NOZ和GBCSD的增殖能力，說(shuō)明EpCAM在膽囊癌細(xì)胞的增殖方面也發(fā)揮了作用。

綜上所述，EpCAM可能通過(guò)促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖和遷移能力從而促進(jìn)膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。EpCAM可考慮作為篩選腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物，也可作為診斷和治療膽囊癌的分子靶點(diǎn)。但其調(diào)控膽囊癌細(xì)胞功能的具體機(jī)制以及在臨床中的應(yīng)用仍需進(jìn)一步探索。