環狀RNA hsa_circ_0000301在胃癌組織中的表達及臨床意義

李琪兒 邵永富 葉國良

胃癌是人類常見的惡性腫瘤，其全球發病率居所有惡性腫瘤第5位，而死亡率排名則高居第3位，其中我國因胃癌病死人數約占全球一半[1-2]。盡管醫學治療手段在不斷發展，但由于大多數患者確診時已處于晚期，導致胃癌的預后仍很差，5年總體生存率僅27%[3-4]。胃癌是一種在組織和分子水平高度異質性的疾病，其發病機制復雜多樣[4]。因此，探索胃癌發生、發展的分子機制、尋找有效的腫瘤標志物以及新的治療靶點仍是胃癌診斷和治療的研究熱點。

環狀RNA是一種普遍存在于真核轉錄組中的具有基因調控作用的非編碼RNA，其具有較高保守性和組織特異性[5]。環狀RNA與癌癥發生、發展密切相關[6]。相較于其他線性RNA，環狀RNA由于其特殊的共價閉環結構而不易被RNA酶所降解，因此具備更高的穩定性[5]，使其成為癌癥診斷的潛在新型標志物[7]。目前有學者已經發現一些具有潛在診斷價值的環狀RNA，如hsa_circ_002059[8]、hsa_circ_0000096[9]和 hsa_circ_0001895[10]等在胃癌組織中表達下調，hsa_circ_0058246[11]和hsa_circ_102958[12]等則表達上調。Li等[13]通過基因芯片篩選出343個在胃癌患者血漿中表達異常的環狀RNA，其中hsa_circ_0000301是表達上調最為明顯的環狀RNA之一。然而，hsa_circ_0000301在胃癌患者中表達情況尚不明確。本研究進一步探索hsa_circ_0000301在胃癌組織中的表達情況，并結合臨床病理因素分析該環狀RNA的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 樣本采集 選取2013年1月至2016年12月于寧波大學醫學院附屬醫院經手術切除的96例胃癌患者的癌組織及配對癌旁組織，其中男65例，女31例，年齡27～80（62.3±10.5）歲。根據 hsa_circ_0000301 在胃癌組織和癌旁組織中的表達水平分為兩組：高表達組（癌組織表達水平高于癌旁組織）28例和低表達組（癌組織表達水平低于癌旁組織）68例。所有患者術前均未接受過放化療及靶向治療等全身治療。所有胃癌組織均經病理學檢測證實，癌旁組織標本均取自于同一患者的手術切除標本，距離腫瘤邊緣超過2 cm，且病理學檢測證實為非癌組織。采集的新鮮組織標本立即浸泡于無氮樣品保存液中，并放入-80℃冰箱中保存備用。本研究經本院醫學倫理委員會批準（2013GZ020），所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 hsa_circ_0000301表達水平檢測 采用RT-qPCR法。采用Trizol（美國Invitrogen公司，批號：260712，100 ml）試劑提取組織標本中總RNA，總RNA濃度采用核酸蛋白分析儀測定，根據A260/A280比值以及用1.5%非變性瓊脂糖凝膠電泳條帶完整性鑒定總RNA的質量。將提取的總RNA使用GoScript逆轉錄試劑盒（美國Promega 公司，批號：0000323588，100 reactions）逆轉錄成cDNA。以cDNA為模板，采用GoTaq qPCR Master Mix試劑盒（美國 Promega 公司，批號：0000372782，25 ml）在Mx3005P熒光定量PCR儀（美國Stratagene公司）上進行RT-qPCR。hsa_circ_0000301的引物序列：正向：5′-AGCAGGAAGGTGTGAGCTGG-3′，反向：5′-TGCCTGCTTACAGCCACTCA-3′；外參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的引物序列：正向：5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′反向：5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′。擴增條件設定為：95℃5 min預變性，95℃ 30 s變性，60℃1 min退火，72℃30 s延伸，循環45次。每個樣本進行2次獨立實驗取Ct平均值。環狀RNA的表達水平采用ΔCt法計算，計算公式為：ΔCt=Ct（hsa_circ_0000301）-Ct（GAPDH）。

1.3 隨訪 96例患者出院后均進行隨訪，隨訪方式為電話隨訪和門診隨訪，隨訪內容包括一般情況、臨床癥狀、胃鏡檢查及影像學檢查。隨訪起點為手術日期，末次隨訪時間為2019年12月31日，至隨訪截止日，存活66例，病死30例，無失訪患者。

1.4 hsa_circ_0000301功能注釋 基于circbank[14]數據庫分析hsa_circ_0000301結合的miRNA；miRWalk 2.0[15]數據庫分析miRNA已知靶向的mRNA；采用Cytoscape 3.8.0構建hsa_circ_0000301-miRNA-mRNA網絡圖。采用ToppFun[16]數據庫對has_circ_0000301潛在調控的mRNA進行信號傳導通路和基因本體論（GO）富集。

2 結果

2.1 胃癌和癌旁組織中hsa_circ_0000301表達水平比較 hsa_circ_0000301在胃癌組織中的表達水平明顯低于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 胃癌和癌旁組織中hsa_circ_0000301表達水平比較（**P＜0.01；ΔCt值越大，表達水平越低）

2.2 不同臨床特征胃癌患者的hsa_circ_0000301表達水平比較 見表1。進一步分析hsa_circ_0000301的表達水平與胃癌患者不同臨床特征的關系，結果顯示，發生胃癌遠處轉移、復發以及癌胚抗原陽性患者hsa_circ_0000301表達水平均明顯升高（均P＜0.05）。

表1 不同臨床特征胃癌患者hsa_circ_0000301表達水平比較

2.3 不同hsa_circ_0000301表達水平胃癌患者生存比較 低表達組患者總生存期（HR=0.285，95%CI：0.107～0.757，P＜0.05）以及無病生存期（HR=0.375，95%CI：0.173～0.812，P＜0.05）均明顯短于高表達組，見圖 2。

圖2 不同hsa_circ_0000301表達水平胃癌患者的生存曲線比較（a：總生存期比較；b：無病生存期比較）

2.4 hsa_circ_0000301對胃癌的診斷價值 ROC曲線分析結果顯示hsa_circ_0000301診斷胃癌的AUC為0.672，且當截斷值為8.57時，其靈敏度為0.72，特異度為 0.62，見圖 3。

圖3 hsa_circ_0000301診斷胃癌的ROC曲線

2.5 Hsa_circ_0000301潛在功能分析 通過構建hsa_circ_0000301-miRNA-mRNA調控網絡顯示，hsa_circ_0000301作為hsa-miR-1178-3p和hsa-miR-362-3p的分子海綿，可分別間接調控下游211個和106個靶基因表達，見圖4a。對下游靶基因通路和GO富集進一步分析發現hsa_circ_0000301具有多種生物學功能，其中包括具有調控JNK、Wnt等與胃癌發生密切相關的信號傳導通路的潛能，見圖4b-c。

圖4 hsa_circ_0000301潛在功能分析（a：hsa_circ_0000301-miRNA-mRNA調控網絡；b：hsa_circ_0000301下游信號傳導通路；c：hsa_circ_0000301基因本體論富集）

3 討論

我國為胃癌高發地區，胃癌的發病率居惡性腫瘤第2位[17]。目前胃癌的診斷主要依靠胃鏡檢查，而我國是人口大國，醫療資源有限，胃鏡檢查作為一種有創檢查耗時、耗力，因此并不是篩查、隨訪的最佳手段，與之相比腫瘤標志物檢查則更為方便，但現有的腫瘤標志物如糖類抗原（CA）19-9和癌胚抗原（CEA）對胃癌檢測的靈敏度和特異度均不理想[18]，因此人們致力于探索新型的分子標志物。環狀RNA作為一種非編碼RNA，因其穩定性高且表達具有組織特異性，而被認為是理想的分子標志物。研究表明hsa_circ_002059和hsa_circ_0000096等具有胃癌診斷價值。本研究結果發現hsa_circ_0000301在胃癌組織中的表達較配對的癌旁組織明顯降低，ROC曲線分析hsa_circ_0000301診斷胃癌的靈敏度和特異度分別為0.72和0.62，而目前傳統的腫瘤標志物CEA和CA199-的靈敏度僅分別為0.30和0.42[19]。因此，hsa_circ_0000301有望成為理想的診斷胃癌的標志物。

進一步結合臨床病理因素分析，發現hsa_circ_0000 301表達水平越低，越容易出現遠處轉移、越容易復發、且越容易出現組織CEA陽性，這可能是導致hsa_circ_0000301低表達組的總生存期以及無病生存期均明顯短于高表達組的原因。此外，環狀RNA常作為“miRNA海綿”競爭結合miRNA，進而間接調控下游靶基因表達[19]。基于該理論，本研究團隊構建了hsa_circ_0000301-miRNA-mRNA調控網絡，分析發現hsa_circ_0000301可能通過調控JNK[20]、Wnt信號傳導通路[21]等影響胃癌的惡性表型和不良預后。

而Li等[13]通過基因芯片檢測，發現hsa_circ_0000301在胃癌患者血漿中的表達顯著上調，這與本研究中胃癌組織的結果相反。本研究團隊推測hsa_circ_0000301可能通過外泌體等形式大量釋放進入血液，從而導致組織中低表達血漿中高表達。

本研究證實了hsa_circ_0000301作為胃癌相關環狀RNA，其在胃癌組織中表達下調，且其表達下調與胃癌患者的不良預后相關。hsa_circ_0000301具有成為胃癌標志物的潛力，其作用機制尚需進一步研究。