錯配修復(fù)蛋白缺失相關(guān)子宮內(nèi)膜癌的病理特征及其臨床意義

鄧茜 雷瓊 李璐 高尤亮 俞文英 嚴(yán)俊龍 郭亞男 鄭時玉 李海莉 蒙伶俐 盧立霞 李征 夏朝霞

Lynch綜合征即遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌（hereditary non-polyposis colorec-tal cancer，HNPCC）屬于常染色體顯性遺傳病。人體堿基錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR）基因胚系突變后可導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定性，引起廣泛的腫瘤易感性。其中女性Lynch綜合征患者最常發(fā)生的是卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）[1]，一部分女性Lynch綜合征患者以EC為首發(fā)腫瘤，因此在EC患者中篩查Lynch綜合征是可行且必要的。Lynch綜合征確診需依靠費用昂貴的二代測序（next generation sequencing，NGS）檢測MMR基因胚系突變，無法進行大規(guī)模普篩工作，而日常工作中使用的免疫組化檢測MMR蛋白的方法經(jīng)濟快捷，是初步篩查Lynch綜合征的有效手段[2]。目前國內(nèi)有關(guān)MMR蛋白缺陷相關(guān)子宮內(nèi)膜癌（MMR protein deletion-related endometrial carcinoma，dMMR-EC）的研究較少，因此本研究旨在探討dMMR-EC患者的臨床病理特征及其臨床意義，以便指導(dǎo)臨床工作中初步篩查Lynch綜合征患者，進而指導(dǎo)下一步的治療方法和疾病管理。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2014年6月至2017年6月寧波市臨床病理診斷中心診斷的EC患者294例，年齡28～86（56.4±9.4）歲。納入的EC組織學(xué)類型有：子宮內(nèi)膜樣癌、漿液性癌、透明細(xì)胞癌、混合性腺癌、子宮癌肉瘤、未分化癌和去分化癌。組織學(xué)類型不包括中腎腺癌、中腎樣腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、胃腸型黏液腺癌、轉(zhuǎn)移性癌以及宮頸腺癌累及宮體等。本研究經(jīng)本中心醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 病理檢查 復(fù)閱所有患者經(jīng)HE染色后的組織切片，觀察腫瘤組織形態(tài)學(xué)特征、組織學(xué)類型、肌層浸潤情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、組織學(xué)分級分期[按國際婦產(chǎn)科協(xié)會（Federation International of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行]等臨床病理學(xué)特征。

1.3 免疫組化檢測及其抗體信息 所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛溶液固定、脫水、包埋、4 μm切片。免疫組化采用Ventana Benchmark XT自動免疫組化儀（美國Ventana公司）染色。一抗：鼠抗人單克隆抗體MLHl（克隆號：ES05）和兔抗人單克隆抗體MSH2（克隆號：RED2）均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，兔抗人單克隆抗體MSH6（克隆號：EP49）購自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)有限公司，兔抗人單克隆抗體PMS2（克隆號：EP51）購自河南賽諾特生物技術(shù)開發(fā)有限公司。以每張切片中淋巴細(xì)胞、纖維間質(zhì)細(xì)胞或癌旁子宮內(nèi)膜腺體的胞核陽性為陽性內(nèi)對照，陰性內(nèi)對照使用PBS代替一抗。

1.4 二代測序及其主要試劑盒、儀器 每例需進行二代測序的患者均挑取一個含癌組織的蠟塊，切成蠟卷，采用QIAamp DNA FFPE Tissue提取試劑盒（德國QIAGEN公司）提取組織內(nèi)DNA后使用二代測序儀（型號：Hiseq 4000，美國Illumina公司）進行MMR基因的二代測序檢測，DNA capture probes購自南京世和基因生物技術(shù)有限公司。

1.5 結(jié)果判讀 MMR蛋白（包括MLH1、PMS2、MSH2和MSH6）在任何腫瘤細(xì)胞核明確著色即判定為陽性（如圖 1、2、4、5，插頁）[3]；所有腫瘤細(xì)胞核均不著色時即為陰性（如圖3、6，插頁）。間質(zhì)淋巴細(xì)胞、纖維組織細(xì)胞及癌旁子宮內(nèi)膜腺體均可作為陽性內(nèi)對照，有助于分辨假陽性或假陰性。

圖1 子宮內(nèi)膜樣癌病理切片所見（HE染色，×100）

圖2 子宮內(nèi)膜樣癌中MLH1陽性表達（周圍纖維間質(zhì)細(xì)胞或淋巴細(xì)胞陽性表達，陽性內(nèi)對照；免疫組化染色，×100）

圖3 子宮內(nèi)膜樣癌中MSH6陰性表達（周圍纖維間質(zhì)細(xì)胞或淋巴細(xì)胞陽性表達，陽性內(nèi)對照；免疫組化染色，×100）

圖4 子宮內(nèi)膜透明細(xì)胞癌病理切片所見（HE染色，×100）

圖5 透明細(xì)胞癌中MSH2陽性表達（周圍癌旁子宮內(nèi)膜腺體陽性表達，陽性內(nèi)對照；免疫組化染色，×100）

圖6 透明細(xì)胞癌中PMS2陰性表達（周圍癌旁子宮內(nèi)膜腺體陽性表達，陽性內(nèi)對照；免疫組化染色，×100）

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料 294例EC石蠟包埋標(biāo)本中，診斷學(xué)刮宮（以下簡稱診刮）標(biāo)本22例，其余272例中有57例未清掃盆腔淋巴結(jié)，另外215例為EC根治標(biāo)本?；颊吣挲g＜50歲者72例，≥50歲者222例。組織學(xué)類型如下：子宮內(nèi)膜樣癌242例，平均年齡54.7歲；Ⅱ型EC有43例，其中透明細(xì)胞癌12例（平均年齡70.7歲），漿液性癌23例（平均年齡64.7歲），癌肉瘤8例（平均年齡59.6歲）；Ⅰ型和Ⅱ型混合性腺癌2例（平均年齡56.5歲）；去分化癌5例（平均年齡57.4歲）；未分化癌2例（平均年齡55.5歲）。242例子宮內(nèi)膜樣癌中不同F(xiàn)IGO分級占比分別為：Ⅰ級144例（59.5%），平均年齡52.5歲；Ⅱ級76例（31.4%），平均年齡57.1歲；Ⅲ級22例（9.1%），平均年齡61.0歲。FIGO分期：175例Ⅰ型子宮內(nèi)膜樣癌根治標(biāo)本中Ⅰ期137例（78.3%），Ⅱ期25例（14.3%），Ⅲ期13例（7.4%），Ⅳ期0例（0.0%）。23例漿液性癌中18例為根治標(biāo)本，F(xiàn)IGO分期分別為Ⅰ期10例，Ⅱ期2例，Ⅲ期6例，Ⅳ期0例。12例透明細(xì)胞癌中10例為根治標(biāo)本，F(xiàn)IGO分期為Ⅰ期5例，Ⅱ期3例，Ⅲ期2例，Ⅳ期0例。8例癌肉瘤中6例為根治標(biāo)本，F(xiàn)IGO分期Ⅰ期4例，Ⅱ期0例，Ⅲ期2例，Ⅳ期0例。5例去分化EC中，4例非診刮標(biāo)本FIGO分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期者分別各占1例。2例未分化癌均為根治標(biāo)本，F(xiàn)IGO分期分別為Ⅰ期和Ⅱ期?；旌闲桶?例其中1例為根治標(biāo)本，F(xiàn)IGO分期為Ⅰ期。

2.2 MMR蛋白表達情況 294例EC患者中，62例出現(xiàn)MMR蛋白的陰性表達，即為dMMR-EC患者，其余232例MMR蛋白陽性表達。多種組織學(xué)類型的EC均可出現(xiàn)MMR蛋白陰性表達（MMR陰性例數(shù)/總例數(shù)）：子宮內(nèi)膜樣癌（53/242）、透明細(xì)胞癌（1/12）、漿液性癌（2/23）、混合性腺癌（1/2）、癌肉瘤（2/8）、未分化癌（1/2）及去分化癌（2/5）。62例MMR蛋白陰性表達的EC患者可以出現(xiàn)特定組合內(nèi)的單個MMR蛋白陰性表達，也可以出現(xiàn)特定組合內(nèi)的2個MMR蛋白共同陰性表達，但未出現(xiàn)兩個特定組合內(nèi)的蛋白均陰性表達或交叉陰性表達的現(xiàn)象。本組研究62例dMMR-EC（陰性率21.1%）中，MLH1和（或）PMS2陰性表達40例（陰性率13.6%），MSH2和（或）MSH6陰性表達22例（陰性率7.5%）。

2.3 MMR基因二代測序結(jié)果 由于經(jīng)費限制，本研究從62例dMMR-EC患者中按分層隨機的方法挑選出21例進行二代測序檢測MMR基因表達頻譜，進行免疫組化結(jié)果的驗證，結(jié)果21例dMMR-EC患者中有18例腫瘤組織內(nèi)檢測出MMR基因突變，其中10例MSH2和（或）MSH6蛋白陰性組織均出現(xiàn)MMR基因突變，11例MLH1和（或）PMS2蛋白陰性組織中有6例出現(xiàn)MMR基因突變，如圖7（插頁）。

圖7 21例dMMR-EC二代測序MMR基因表達頻譜（dMMR-EC為錯配修復(fù)蛋白缺失相關(guān)子宮內(nèi)膜癌；MMR為錯配修復(fù)）

2.4 MMR蛋白陰性率與患者臨床病理特征的關(guān)系MMR蛋白陰性率與年齡、組織學(xué)類型、非診刮標(biāo)本肌層浸潤深度、根治標(biāo)本淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、FIGO分級和分期均無相關(guān)性（均P＞0.05）。而非Ⅱ型高級別EC患者MMR蛋白陰性率明顯高于Ⅱ型高級別EC患者MMR蛋白陰性率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 MMR蛋白陰性率與EC患者臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.5 隨訪結(jié)果 62例dMMR-EC患者均進行電話隨訪，隨訪時間25～62個月，有效隨訪52例，其中無病生存49例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移2例（隨訪時間分別為40和34個月），病死1例（隨訪時間為60個月）；失訪10例。

3 討論

人類MMR基因可以識別和修復(fù)DNA復(fù)制和重組過程中發(fā)生的錯誤性堿基插入、缺失和一部分DNA損傷，保證DNA高保真復(fù)制，維持染色體的穩(wěn)定性[4]。MMR基因缺陷細(xì)胞的堿基突變率是正常堿基10到1 000倍[5]。目前研究較多的MMR基因類型主要是MLH1、PMS2、MSH2 和 MSH6[6]。

MMR基因缺陷有兩種情況，一種是可遺傳的種系或胚系突變，常常導(dǎo)致Lynch綜合征；另一種就是不可遺傳的體細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞突變。篩查dMMR-EC對識別高復(fù)發(fā)風(fēng)險[7-8]或遺傳性EC患者（如Lynch綜合征）有幫助[8-9]。

Lynch綜合征是MMR基因發(fā)生種系或胚系突變所致的一種常染色體顯性遺傳性疾病，表現(xiàn)為多系統(tǒng)多器官腫瘤易感性（多種組織癌變概率大大增加，如胃、女性生殖道、膽道、尿道、小腸、大腦和胰腺等）。女性Lynch征患者最常發(fā)生的腫瘤是卵巢癌和EC[1]，一部分Lynch綜合征患者以EC為首發(fā)腫瘤。因此，在EC患者中開展Lynch綜合征篩查是可行而必要的，便于及時發(fā)現(xiàn)和預(yù)防患者Lynch綜合征相關(guān)的其他腫瘤的發(fā)生。此外，Lynch綜合征親屬也可以盡早進行遺傳咨詢及基因檢測，預(yù)防發(fā)生Lynch綜合征相關(guān)腫瘤。

免疫組化檢測MMR蛋白的表達是篩查Lynch綜合征相關(guān)腫瘤的有效方法，已經(jīng)普遍應(yīng)用于篩查Lynch綜合征相關(guān)結(jié)直腸癌患者的工作流程[2]，近年來Lynch綜合征相關(guān)EC（Lynch syndrome-related endometrial cancer，Lynch-EC）備受關(guān)注，Scnter等和 Frolova 等[10-11]的研究顯示與MMR基因檢測結(jié)果比較，免疫組化法檢測MMR蛋白的靈敏度、特異度分別為0.91、0.88，因此推薦將免疫組化檢測MMR蛋白作為Lynch-EC的初篩手段。近年來，就Lynch-EC的具體篩查方案、臨床病理學(xué)特征、治療及預(yù)后等是研究熱點[12-15]。因此，本研究通過免疫組化檢測MMR蛋白的表達初步篩查Lynch-EC展開相關(guān)研究。

本組研究中294例EC患者的MMR蛋白陰性率為21.1%（62/294），其中 MLH1和（或）PMS2蛋白陰性率13.6%（40/294），MSH2和（或）MSH6蛋白陰性率 7.5%（22/294），MMR蛋白陰性率在大多數(shù)國內(nèi)外研究報道的范圍內(nèi)，但略低于某些國外報道的45%[16]，有可能是篩查種群及地域不一樣所致。此外，本研究結(jié)果表明多種組織學(xué)類型的EC，包括子宮內(nèi)膜樣癌、透明細(xì)胞癌、漿液性癌、混合性腺癌、癌肉瘤、未分化癌及去分化癌等均可出現(xiàn)MMR蛋白陰性表達。除此以外，不論患者年齡是否＜50歲、腫瘤浸潤肌層是否＞1/2、是否具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及FIGO分級分期程度，MMR蛋白陰性率均無統(tǒng)計學(xué)差異。此結(jié)果支持推薦所有初次確診的EC均進行MMR蛋白檢測以達到Lynch-EC初篩的目的。這一結(jié)論與國內(nèi)外主流觀點基本一致[17]，但Ruiz等[18]的研究表明MMR蛋白陰性病例更常見于浸潤深度＜1/2肌層的病例，而Long等[19]的研究報道MMR蛋白陰性病例具有更深的肌層浸潤，可能是研究對象地域不同所致，也可能數(shù)據(jù)量有限，這需要大數(shù)量級數(shù)據(jù)進一步研究。此外，Pina等[20]研究報道顯示，組織學(xué)類型為去分化EC更容易出現(xiàn)出現(xiàn)MMR蛋白陰性，而本研究入組的去分化EC患者例數(shù)較少，難以進行統(tǒng)計學(xué)分析，因此，有待收集更多的病例進一步研究。

國內(nèi)外多項研究均進行了低級別EC和高級別EC中MMR陰性率的比較，結(jié)果它們的陰性率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，本研究結(jié)果跟上述結(jié)果一致，但本研究進一步把高級別EC分成Ⅱ型癌和非Ⅱ型癌兩組，統(tǒng)計學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)非Ⅱ型高級別EC患者MMR蛋白陰性率（35.5%，11/31）高于Ⅱ型高級別EC患者的（11.6%，5/43），也就是說，組織學(xué)類型為非Ⅱ型高級別的EC時應(yīng)作為Lynch-EC的重點篩查對象，應(yīng)特別注意是否有MMR蛋白陰性，并進一步明確是否為Lynch-EC。

2013年，美國癌癥基因組圖譜提出將EC區(qū)分為DNA聚合酶ε（POLE）突變型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite Instability，MSI）高突變型、高拷貝數(shù)型和低拷貝數(shù)型4種分子亞型[21]。2015年Talhouk等[22]使用免疫組化替代基因分型的方案，證明基于免疫組化檢測MMR蛋白篩選MSI高突變型EC是可行的。2020年，EC的分子分型以及基于免疫組化的分子分型方案被正式寫入第5版《WHO女性生殖腫瘤分類》中并且指出這4種分子分型中POLE突變型和MSI高突變型預(yù)后最好，其次為低拷貝數(shù)型，而高拷貝數(shù)型預(yù)后最差。本研究篩選的62例dMMR-EC基本可等同于MSI高突變型EC，預(yù)后相對較好，隨訪資料與此相符。對部分dMMR-EC（21例）進行的基因水平的驗證，結(jié)果21例dMMR-EC中16例出現(xiàn)對應(yīng)MMR基因突變（16/21，76.2%），其中10例MSH2和/或MSH6蛋白陰性的病例NGS結(jié)果均出現(xiàn)對應(yīng)的基因突變（10/10，100.0%），11例 MLH1和/或 PMS2蛋白陰性的病例6例NGS結(jié)果出現(xiàn)對應(yīng)的基因突變（6/11，54.5%），說明MSH2和/或MSH6的免疫組化與NGS基因檢測結(jié)果的一致性優(yōu)于MLH1和（或）PMS2的。

眾多研究表明MMR缺失的多種腫瘤（包括dMMREC）受益于程序性細(xì)胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）單抗的治療。2015 年，Le 等[23]的研 究 顯示PD-1單抗pembrolizumab對MMR缺陷型腫瘤的治療作用明顯高于MMR正常表達的腫瘤。2017年，Le等[24]研究發(fā)現(xiàn)12種MMR缺陷型腫瘤的86例晚期患者使用pembrolizumab治療后，57%的患者出現(xiàn)影像學(xué)層面的病情緩解，21%的患者獲得完全緩解。2017年6月，美國臨床腫瘤協(xié)會推薦PD-1單抗治療EC尤其是dMMR-EC患者[25]。因此，臨床工作中篩查出dMMR-EC患者對其進一步的治療具有一定的指導(dǎo)意義，這一點在一些需要術(shù)后輔助治療的高級別EC中顯得尤其重要。這也是本研究的意義之一：把高級別EC里的dMMR-EC用免疫組化篩選出，可以個體化制定有效的治療方案。

綜上所述，本研究通過免疫組化檢測EC中MMR蛋白的表達，分析EC組織中MMR蛋白陰性率與其臨床病理特征的相關(guān)性，指出推薦所有初次確診的EC患者進行免疫組化檢測MMR蛋白的表達，進行Lynch-EC初篩，其中非Ⅱ型高級別EC是重點篩查對象。本研究進一步討論了在實際臨床工作中使用免疫組化檢測EC組織中 MMR蛋白的表達意義：（1）有助于開展Lynch-EC的初篩工作，對預(yù)防Lynch-EC患者本人再次發(fā)生或家族其他成員發(fā)生Lynch綜合征相關(guān)的腫瘤有一定意義；（2）有助于將預(yù)后不同的高級別EC進行分組，并指導(dǎo)相應(yīng)的藥物治療（如可受益于PD-1單抗治療），利于高級別EC的疾病管理。