優化CD45免疫磁珠陰性篩選法提高循環腫瘤細胞富集效率的實驗研究

蔣來 劉勇 楊立濤

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）發病率位居世界惡性腫瘤的第三位，其中美國、歐洲和東亞地區人群發病率較高[1]。對于局部晚期和轉移性CRC患者，雖然采取多學科綜合治療，但仍有近1/3的患者死于腫瘤轉移和疾病進展[2]。隨著轉移性腫瘤細胞的檢測技術和平臺的開發，腫瘤細胞液體活檢技術逐步用于臨床，以提高轉移病灶的檢出率和治療成功率[3]。在液體活檢計數中，作為主要成分的循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）可攜帶外周血液循環中活腫瘤細胞的生物信息，有助于轉移病灶的臨床治療。由于腫瘤患者外周血中CTC含量極低，臨床上如何提高CTC的富集效率仍具有較高的技術挑戰性[4-5]。上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、細胞角蛋白（cytokeratin，CK）廣泛表達于多數上皮來源的惡性腫瘤，常作為富集CTC的主要標志物[6-7]。雖然腫瘤生物標志物在腫瘤細胞中具有較好的特異性，但由于富集過程中腫瘤細胞易丟失，導致CTC的富集效率較低。在CTC的陰性富集過程中，CD45+白細胞的去除是關鍵步驟，該步驟通過抗體結合和磁場分離電荷將白細胞從提取液中移除，留下帶有腫瘤細胞的溶液[8]。根據筆者前期CTC富集結果和實驗操作，發現部分CD45-的腫瘤細胞被磁場中白細胞團塊包繞并鎖定在試管壁上，同時與白細胞一起被移除，導致腫瘤細胞的富集效率低下。為提高富集效率，筆者在實驗中將本該與白細胞一起移除的試管進行再次洗脫和磁場分選，從而將白細胞團塊包繞的腫瘤細胞提取出來，以提高CTC的富集效率。為了驗證假設，筆者將生長良好的SW620細胞按照不同的細胞數量加入健康獻血者的血液以模擬CTC，采用設計的優化方案富集腫瘤細胞，并與常規方案進行比較，以評估優化方案的富集效率。

1 材料和方法

1.1 細胞與材料 SW620細胞為EpCAM+/CK+/CD45-人結腸癌細胞，購自ATCC細胞庫。RBC裂解緩沖液（規格：10 ml，型號：Cat-20120）、CD45 混合物（規格：50 μl/ml，型號：Cat-18259）、免疫磁珠（規格：100 μl/ml，型號：Cat-18259）均購自加拿大Stem Cell公司；EpCAM抗體（規格：20 μl，型號：347199）及其同型對照（規格：20 μl，型號：347221）、PE 偶聯的 CK 抗體（規格：20 μl，型號：347204）及其同型對照（規格：20 μl，型號：555574）均購自美國BD公司。

1.2 CTC模擬 將SW620細胞加入健康獻血者的血液中，以模擬CTC和患者血液。首先采集健康獻血者外周血約5 ml于肝素真空管中，室溫下儲存于恒溫培養箱中。同時將穩定生長的SW620細胞打散后用血細胞計數儀計數，使每1 ml PBS中含有50、75、100、150個SW620細胞。然后將5 ml健康獻血者血樣緩慢加入20 ml 1×RBC裂解緩沖液中，再加入一定量的SW620細胞（50、75、100和150個細胞）。常規孵育和離心后，去除裂解的紅細胞，收集細胞懸液（白細胞和腫瘤細胞），計數細胞后進一步去除CD45+白細胞。

1.3 富集方案 （1）常規方案：使用人CD45去除試劑盒（包括CD45混合物和免疫磁珠結合白細胞）[9]。將帶有細胞懸液的試管放入磁鐵中，CD45+白細胞在磁場作用下可貼于試管壁，細胞懸液中剩下CD45-腫瘤細胞；將含CD45-腫瘤細胞的上清液移入流式細胞管中，使用流式細胞儀進行腫瘤細胞分選和細胞計數。（2）優化方案：對含有貼壁CD45+白細胞的試管重新進行沖洗和磁場作用，以洗脫被白細胞包繞和貼壁的腫瘤細胞，對其重新進行富集，見圖1。

圖1 常規方案和優化方案（第2次免疫磁珠陰性富集）進行CTC富集圖示（CTC為循環腫瘤細胞）

1.4 常規方案正常劑量與高劑量CD45混合物+免疫磁珠富集SW620細胞效率驗證 去除白細胞時，分別加入正常劑量的 CD45混合物（50 μl/ml）+免疫磁珠（100 μl/ml）、高劑量的 CD45 混合物（62.5 μl/ml）+免疫磁珠（125 μl/ml），對 CD45+白細胞進行結合和分離，以驗證CD45混合物和免疫磁珠是否可以通過結合更多的白細胞和包繞更多的CD45-腫瘤細胞來降低腫瘤細胞富集效率的假設。

1.5 SW620細胞富集效率檢測 采用EpCAM和CK雙抗體染色、流式細胞術進行分選和計數。去除CD45+白細胞后，使用EpCAM抗體及其同型對照進行表面細胞膜染色，然后使用PE偶聯的CK抗體15 μl進行細胞內染色；取細胞懸液，采用流式細胞術進行分選和計數。SW620細胞富集效率=富集細胞個數/加入的SW620細胞數×100%。

2 結果

2.1 常規方案正常劑量與高劑量CD45混合物+免疫磁珠富集SW620細胞效率比較 在常規方案中，正常劑量CD45混合物+免疫磁珠富集SW620細胞的平均效率為65.5%，高于高劑量CD45混合物+免疫磁珠富集SW620細胞的平均效率58.3%，見表1。這證實CD45混合物和免疫磁珠可以通過結合更多的白細胞和包繞更多的CD45-腫瘤細胞來降低腫瘤細胞富集效率。

表1 正常劑量與高劑量CD45混合物+免疫磁珠富集SW620細胞效率比較[個（%）]

2.2 常規方案與優化方案富集SW620細胞效率比較 采用優化方案富集SW620細胞的平均效率為82.8%，高于常規方案富集SW620細胞的平均效率61.9%，見表2和圖2（插頁）。

圖2 常規方案與優化方案對150個SW620細胞富集效率的流式細胞術檢測結果（a-c：采用常規方案，分別顯示總細胞、CD45-細胞、CK+EpCAM+細胞數目為 287 535、21 815、91個；d-f：采用優化方案，分別顯示總細胞、CD45-細胞、CK+EpCAM+細胞數目為 718 072、60 208、35個；CK為細胞角蛋白；EpCAM為上皮細胞黏附分子）

表2 常規方案與優化方案富集SW620細胞效率比較[個（%）]

3 討論

CRC是一種常見的消化道惡性腫瘤，疾病相關死亡率與腫瘤轉移密切相關。CTC是腫瘤轉移的重要途經和步驟，但CTC的精準分選和有效富集是CTC檢測的重要障礙，主要原因是缺乏特異性的CTC生物標志物以及CTC富集過程中腫瘤細胞的丟失[10]。CTC富集的典型過程包括紅細胞溶解、白細胞去除（陰性篩選）和CTC捕獲（陽性選擇）[11]。為了更好地分離和鑒定CTC，需要用CD45去除白細胞，然后采用熒光抗體染色方法從血液樣本中捕獲CTC，上皮性腫瘤標志物（EpCAM、CK）因其在腫瘤細胞表達但在白細胞中表達缺失而被用于CTC的捕獲[12]。EpCAM、CK在大多數腫瘤細胞中高表達，在白細胞中不表達，因此常用于CTC的富集和捕獲[13]。CTC陽性富集容易丟失部分有價值但不表達上皮性腫瘤標志物的CTC，而CTC陰性富集可以通過去除CD45+白細胞而富集CD45-的CTC，將不表達上皮性腫瘤標志物的CTC加以富集，從而提高CTC的富集效率[14]。CTC陰性富集也有不足，即在去除CD45+白細胞的操作步驟中易丟失部分CTC，導致CTC富集效率不高。因此，本文從CTC陰性富集過程中的CTC丟失入手，通過優化CTC富集流程，以提高CTC富集效率。

在多個CTC富集步驟中，白細胞去除是可以優化的步驟，因為數百萬個CD45+白細胞在磁場作用下貼附于試管壁，這同時也會將部分腫瘤細胞加以包繞和貼附，使這些腫瘤細胞與CD45+白細胞一起被移除，導致其無法進入下一步的細胞分選和計數過程[15]。因此，筆者認為對此步驟加以優化，可以有效提高CTC的富集效率。首先，本研究比較了正常劑量與高劑量CD45混合物+免疫磁珠富集SW620細胞的效率，兩組按正常CTC富集方案進行CD45+白細胞的移除，然后對附在試管壁的白細胞和腫瘤細胞用PBS進行洗脫和第二輪CD45+白細胞移除，結果顯示正常劑量CD45混合物+免疫磁珠富集SW620細胞的平均效率（65.5%）高于高劑量組（58.3%），提示高劑量CD45混合物和免疫磁珠在CD45+白細胞移除階段可以包繞更多的腫瘤細胞，使CTC富集數量減少。這驗證了筆者的假設：在CD45+白細胞移除步驟中，腫瘤細胞被貼壁的白細胞固定于試管壁，被當作陰性對照導致丟失，使得陰性篩選的富集效率不高。因此本研究優化富集方案，對貼壁細胞進行洗脫和重新富集，結果顯示優化方案富集SW620細胞的平均效率（82.8%）高于常規方案（61.9%）。

綜上所述，優化CD45免疫磁珠陰性篩選法（對含有貼壁CD45+白細胞的試管再次洗脫和磁場分選）能提高CTC富集效率，具有較好的臨床應用價值。但今后仍需精準的、大樣本的臨床試驗來驗證，使富集CTC的實驗方案更加完善。