睡眠方顆粒劑對失眠大鼠模型的治療作用及機制

馬澤彬,王書玉,閆 欣,張曉鹿,許大慶

失眠是一種常見的臨床癥狀,在成人中符合失眠癥診斷標準者在10%～15%，近半數嚴重失眠者可持續10年以上[1]。其特征是難以啟動或維持睡眠[2]，嚴重影響人們的正常生活與工作，逐漸成為業界高度重視的疾病之一。睡眠方水丸治療頑固性失眠具有顯著的臨床療效。目前在臨床中使用的是傳統制劑水丸，但水丸存在療效慢、水分含量高、容易霉變且不易保存等問題。而顆粒劑攜帶和運輸方便、味甜、服用簡便，患者樂于服用[3]。將睡眠方水丸改變劑型，制備成睡眠方顆粒劑，改變劑型后的睡眠方顆粒劑作用效果如何尚不清楚。本文采用對比的方法，比較同等劑量下睡眠方顆粒劑與睡眠方水丸的治療效果，以5-羥色胺(5-HT)和多巴胺(DA)為靶點，觀察顆粒劑與丸劑對對氯苯丙氨酸(PCPA)誘導的失眠大鼠的影響,進一步明確睡眠方顆粒劑的作用效果，為臨床上應用提供更多實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 動物：SPF級健康SD大鼠48只，雌雄各半，體重(200±20)g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產證號：SCXK(寧)2020—0001，分籠進行標準飼料喂養。實驗前大鼠在室溫20～22 ℃，相對濕度 45%～65%環境下適應性喂養1周，自由飲水。

1.1.2 試藥：睡眠方水丸/顆粒劑方劑，由菟絲子、龍骨、傘菌、藜蘆、青鹽、薰衣草、芒硝等組成。本方所用藥物：菟絲子，批號：1911319；龍骨，批號：2003259；藜蘆，批號：1701155；青鹽，批號：1807084；薰衣草，批號：1906150，均由寧夏明德中藥飲片有限公司生產。芒硝，批號：5660018091，河北雙寧藥業有限公司。上述中藥飲片均購自于銀川市第一人民醫院，經鑒定符合國家藥典標準。

1.1.3 試劑與儀器：5-HT Elisa試劑盒，產品批號：U4AQJA2PUG，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；DA Elisa試劑盒，產品批號：IHUU7H8FAG，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；PBS緩沖液，產品批號：0033519，Biological Industries，上海逍鵬生物科技有限公司；對氯苯丙氨酸(PCAP)，產品批號：S02S11Y123233，上海源葉生物科技有限公司；連續波長及核酸蛋白微量檢測酶標儀，產品型號：INFITEM200PRO，瑞士/tecan；微型高速離心機。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備：將 48只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、睡眠方水丸組和睡眠方顆粒劑組。除正常組外，其余大鼠均建立失眠模型。方法：對氯苯丙氨酸(PCPA)，用量350 mg/(kg·d)。除正常組以外，其它各組大鼠腹腔注射PCPA混懸液。每天上午10：00開始腹腔注射，1次/d，連續注射3 d；正常組腹腔注射等體積的0.9%生理鹽水。于第1次腹腔注30 h 后，觀察大鼠出現異常興奮，晝夜節律消失，活動不停，與正常組比較區別明顯，則提示造模成功。

1.2.2 給藥方法：PCPA腹腔注射3 d后，觀察大鼠一般狀態變化，確保造模成功，予以灌胃治療，每天早晨08:00開始，1次/d，連續灌胃7 d。其中正常組、模型組大鼠連續7 d各給予0.9%生理鹽水標準灌胃；睡眠方水丸組、睡眠方顆粒劑組大鼠各3 g/kg標準灌胃，連續治療7 d(均參照60 kg成人常規臨床用量折算出大鼠用量給予灌胃)。

1.2.3 腦組織取材及處理：灌胃第7天晚上禁食供水12 h，第8天上午腹腔注射水合氯醛麻醉后斷頭，在冰面上迅速取出大腦，進行稱重，加同等體積的PBS洗去血液，冰浴手動勻漿，待沒有組織塊，按檢驗試劑盒要求離心10 min，取上清液超濾后進樣。

1.2.4 檢測指標：觀察各組大鼠建模及治療后一般狀態變化，比較各組大鼠體質量變化，測定比較各組大鼠腦組織神經遞質5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)含量。

2 結果

2.1 各組大鼠建模及治療后一般狀態情況：經實驗觀察大鼠在造模后未出現死亡情況發生，治療后也未出現死亡情況。經觀察正常組大鼠活動晝夜節律正常，毛發光澤有度，反應敏捷，糞便顏色正常；造模組經過腹腔注射PCPA混懸液后，明顯出現興奮狀態，晝夜活動加劇。在第1天造模后，大鼠攻擊性明顯增強，加大了第2天造模的難度。大鼠造模3 d 后，毛發變得粗糙，光澤度不夠，精神狀態不佳，糞便灰白；經睡眠方顆粒劑與睡眠方水丸的治療后，與模型組比較，大鼠精神癥狀得到改善，活動節律恢復，毛發逐漸恢復光澤，攻擊性逐漸下降，糞便顏色恢復正常。結果說明睡眠方顆粒劑與睡眠方水丸在一定程度上改善了大鼠的一般精神狀態。

2.2 各組大鼠體質量情況：模型組、睡眠方顆粒劑組與睡眠方水丸組，對PCPA造模后的大鼠體質量與正常組大鼠相比，體質量顯著降低(P<0.05)，表明大鼠成功被造模，失眠可引起大鼠體質量增加緩慢；與模型組相比，睡眠方顆粒劑組與睡眠方水丸組大鼠體質量明顯升高(P<0.05)，表明睡眠方顆粒劑與睡眠方水丸可以改善失眠大鼠的體質量；與睡眠方水丸組相比，睡眠方顆粒劑組大鼠體質量差異無統計學意義(P>0.05)，表明睡眠方顆粒劑對改善大鼠的體質量增長值與睡眠方水丸一致，見表1。

表1 各組大鼠體質量的比較

2.3 各組大鼠腦組織5-HT和DA含量情況：與正常組比較，模型組大鼠腦組織5-HT含量顯著下降(P<0.05)，DA含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，睡眠方顆粒劑組與睡眠方水丸組大鼠腦組織5-HT含量顯著升高(P<0.05)，DA含量顯著下降(P<0.05)；與睡眠方水丸組比較，睡眠方顆粒劑組大鼠腦組織5-HT和DA含量差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠腦組織5-HT和DA含量的比較

3 討論

睡眠方水丸是我院臨床中用于治療失眠的代表方藥，在臨床上使用效果顯著。臨床效果顯示其可以改善失眠患者的癥狀，在我院使用較為廣泛。本實驗選用睡眠方水丸作為陽性對照藥，具有一定代表性。

根據《湯液本草·東垣先生用藥心法》中記載 “丸者，緩也，不能速去之，其用藥之舒緩而治之意也”，丸劑適用于慢性疾病的治療[4]。水丸具有制備簡便、成本較低等優點，但是水丸與藥物的實際療效和中藥飲片的質量有密切的關系[5]，產地不同、炮制不當、儲存不佳都會影響水丸的療效。且在實際服用過程中用量大，吞服困難，生物利用度低，不易消化并存在難以長時間保存。作者認為治療失眠疾病需要選擇更加優化的劑型，便于患者隨身攜帶，服用方便。隨著新技術、新方法的引進，中藥顆粒劑在臨床上應用逐漸廣泛[6]，顆粒劑具有服藥方便、便于攜帶與儲藏[7]的特點，臨床效果優點較多[8]，適合慢性疾病長期使用，有效地避免了長期服用對胃腸道造成的傷害。作者在睡眠方水丸的療效基礎之上，將水丸制成顆粒劑，便于臨床使用，但是經過改變制劑后的藥物治療失眠作用的療效是否會發生相應改變不得而知。因此，本研究主要觀察睡眠方顆粒劑對失眠大鼠模型的治療作用，初步探討其作用機制。

目前治療失眠的觀察指標公認為是通過改變單胺類神經遞質的水平表達，從而反映失眠癥狀是否得到改善。研究顯示，單胺類神經遞質對于睡眠的調節具有至關重要的作用[9]，其中DA可使大腦皮質層產生興奮[10]，在睡眠時血清多巴胺水平低于覺醒時的水平；5-HT 具有中樞調控作用[10]，既促進覺醒[11]，又可以增加睡眠[12]。林昭伶等[13]采用網絡藥理學的方法探索黃連阿膠湯的有效成分及治療靶點，研究顯示在睡眠周期剛開始時，松果體會釋放大量5-HT，激動腦干內的5-羥色胺受體，誘導人們入睡。研究證實5-羥色胺的表達是睡眠與覺醒的重要部分。蒙華琳等[14]對60只雄性失眠大鼠進行研究發現，與模型組比較，腎氣丸組的大鼠血漿中DA 含量顯著降低，認為DA 與睡眠存在關聯性， DA升高人們就會處于興奮狀態，影響正常入睡。張羽翀等[15]對氯苯丙氨酸致失眠大鼠的催眠作用進行研究發現，與模型組比較，五味子木脂素治療組可顯著提高下丘腦 5-羥色胺的水平，研究認為 5-羥色胺神經元能夠通過上行投射影響下丘腦高級中樞,下丘腦中的5-羥色胺是參與睡眠-覺醒調節的重要調節遞質。由此可見，眾多指標中5-HT和多巴胺是研究睡眠機制的重要指標。

本實驗研究證實，大鼠在造模及治療后未出現死亡情況發生，說明造模安全，藥物經過劑型改變后并未產生毒性，未對大鼠造成傷害，治療也是在安全范圍之內。與正常大鼠比較，模型組及治療組在未給藥之前，睡眠節律及反應能力、毛發均有所改變，說明大鼠造模與作者預想的造模成功后的表現是一致的，顯示造模成功。經睡眠方顆粒劑與睡眠方水丸的治療后，與模型組比較，大鼠一般狀態得到明顯改善，說明睡眠方顆粒劑與睡眠方水丸在一定程度上改善了大鼠的一般精神狀態。成功造模的失眠大鼠體質量增加緩慢，但經過治療后顯示睡眠方顆粒劑與睡眠方水丸劑量組大鼠體質量明顯升高，說明治療藥物有作用，且睡眠方顆粒劑與睡眠方水丸改善失眠大鼠的體質量增長一致，并無差異。與模型組比較，睡眠方顆粒劑組大鼠腦組織5-HT含量為2.30 μg/g，睡眠方水丸劑量組大鼠腦組織5-HT含量為2.36 μg/g，均呈顯著升高趨勢；睡眠方顆粒劑組大鼠腦組織DA含量為2.79 μg/g，睡眠方水丸劑量組大鼠腦組織DA含量為2.83 μg/g，均呈顯著下降趨勢；與睡眠方水丸組比較，睡眠方顆粒劑組大鼠腦組織5-HT和DA含量差異無統計學意義(P>0.05)。通過本實驗的結果提示，經過改變劑型后，睡眠方顆粒劑對失眠大鼠模型的治療作用與睡眠方水丸一致，說明改變劑型后并未改變其療效，調節大鼠腦組織5-HT和DA的水平是睡眠方顆粒劑的作用機制之一。