IL-1β、IL-6、TNF-α及TGFβ1基因多態性與多囊卵巢綜合征風險的傾向性評分匹配分析

屈海蓉，韓彩寧，張洪煒，李 瓊，張心愿，哈春芳

多囊卵巢綜合征(PCOS)近年來發病率逐漸升高，有5%～10%[1]的育齡婦女受其困擾，所造成的高雄激素、肥胖、胰島素抵抗、月經紊亂等，給患者的生活帶來了不良影響。PCOS發病機制復雜[2]，提示PCOS的發生與炎癥相關，有明顯的家族聚集性，也提示其發生可能與遺傳相關[3-4]。因此，從相關炎癥因子基因關聯的單核苷酸多態性(SNP)層面探討PCOS的發病原因，對于PCOS的診治具有重要的意義。IL-1β、IL-6、TNF-α及TGFβ1為臨床上常見的炎癥因子，多項國外研究表明上述炎癥因子水平在PCOS患者體液中明顯升高[5-6]，但目前國內針對炎癥因子基因多態性與PCOS相關性的研究相對較少。故本研究基于此，通過查閱文獻，旨在探討IL-1β基因-511位點、IL-6基因rsl800796位點、TNF-α基因rs4645843位點及TGFβ1基因-869位點基因型多態性與PCOS的相關性，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2018年6月-2020年6月我院診治的103例PCOS患者作為PCOS組，

1.1.1 納入標準：①臨床表現、實驗室檢查及影像學檢查等符合《多囊卵巢綜合征中國診療指南》中相關的診斷標準[7]；②年齡為28～40歲的育齡婦女；③所有患者對本試驗知情并簽署知情同意書。

1.1.2 排除標準：①近3個月有使用過免疫抑制劑；②合并惡性腫瘤(特別是卵巢癌)；③合并其他易導致激素水平異常的內分泌系統疾病；④合并腎上腺皮質增生。選取同期正常體檢的171例女性患者作為對照組(納入標準為同年齡段女性，且經體檢檢查未發現明顯異常癥狀體征和陽性輔助檢查項目)。本研究通過本院倫理委員會審核并批準。2組患者一般資料比較結果顯示PCOS組患者BMI、吸煙及飲酒比例明顯高于對照組(P<0.05)，而2組患者年齡、陰道清潔度相比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 2組患者匹配前一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 傾向性評分匹配:根據未匹配前PCOS組和對照組患者的臨床資料，將2組患者中存在偏移的臨床資料作為協變量，包括BMI、吸煙、飲酒，使用Logistic回歸模型計算傾向性評分，按照傾向性得分是否接近進行l∶l匹配，整個傾向性匹配分析使用R語言Matching軟件包進行實施。

1.2.2 標本采集:抽取所有患者5 mL空腹靜脈血，使用3.2%檸檬酸抗凝管抗凝，以3 000 r/min離心后取下層紅細胞及白細胞，置于-80 ℃醫用冰箱中保存，用于提取基因組DNA。

1.2.3 IL-1β、IL-6、TNF-α及TGFβ1基因多態性位點檢測:①引物。所用引物均由合肥知恩生物技術有限公司提供，所用引物見表2。②反應條件。所有基因PCR反應體系體積為25 μl，含DNA樣品2 μl，10×緩沖液2.5 μl，三磷酸脫氧核苷(dNTP)0.5 μl，耐熱DNA聚合酶0.5 μl，上下游引物各0.5 μl，雙蒸水18.5 μl。③循環條件。a.IL-1β基因-511位點，預變性94 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共30個循環，72 ℃延伸5 min；b.IL-6基因rs1800796位點，預變性95 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、61 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35個循環，72 ℃延伸10 min；c.TNF-α基因rs4645843位點，預變性95 ℃ 5 min、94 ℃ 45 s、59.5 ℃ 45 s、72 ℃ 1.5 min，共30個循環，72 ℃延伸5 min；d.TGFβ1基因-869位點，預變性94 ℃ 5 min、94 ℃ 40 s、56 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s，共35個循環，72 ℃延伸5 min。④PCR產物電泳檢測。取4 μl擴增產物，經3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，判讀炎癥因子基因位點的基因型及等位基因頻率。

表2 IL-1β、IL-6、TNF-α及TGFβ1基因各位點引物序列

1.3 觀察指標:IL-1β、IL-6、TNF-α及TGFβ1基因多態性的比較，經傾向性評分匹配后，比較2組人群IL-1β基因-511位點、IL-6基因rsl800796位點、TNF-α基因rs4645843位點及TGFβ1基因-869位點基因型及等位基因頻率，并采用Logistic回歸模型對不同基因型及等位基因與PCOS的相關性進行分析。

2 結果

2.1 采用最臨近匹配法:匹配比例1∶1，卡鉗值設為0.02，以PCOS組為基準組進行匹配，2組共85例對匹配成功，在2組間的協變量經匹配后均達到平衡，經PSM個協變量的均衡性得到了明顯提高(P>0.05)，見圖1(目錄后)與表3。

表3 匹配后2組一般資料比較

2.2 2組IL-1β基因-511位點基因型比較:PCOS組-511位點基因型頻率組間比較差異有統計學意義，TT基因型頻率顯著高于對照組(P<0.05)，且T等位基因頻率高于對照組(P<0.05)，見表4。

表4 2組IL-1β基因-511位點基因型及等位基因比較[n(%)]

2.3 2組IL-6基因rs1800796位點基因型及等位基因比較:2組患者rs1800796位點基因型及等位基因頻率相比差異無統計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 2組IL-6基因rs1800796位點基因型及等位基因比較[n(%)]

2.4 2組TNF-α基因rs4645843位點基因型比較:PCOS組rs4645843位點基因型頻率組間比較差異有統計學意義，CC基因型頻率顯著高于對照組(P<0.05)，且C等位基因頻率顯著高于對照組(P<0.05)，見表6。

表6 2組TNF-α基因rs4645843位點基因型及等位基因比較[n(%)]

2.5 2組TGF-β1基因-869位點基因型及等位基因比較:2組患者-869位點基因型及等位基因頻率相比差異無統計學意義(P>0.05)，見表7。

表7 2組TGF-β1基因-869位點基因型及等位基因比較[n(%)]

2.6 IL-1β、TNF-α基因多態性及等位基因與PCOS的相關性分析:多因素Logistic回歸分析顯示，IL-1β基因-511位點TT基因型(OR=1.974，P<0.05)、T等位基因(OR=2.061，P<0.05)是PCOS發生的危險因素，TNF-α基因rs4645843位點TT基因型(OR=0.449，P<0.05)、T等位基因(OR=0.674，P<0.05)是抑制PCOS發生的保護因素，見表8-表9。

表8 IL-1β基因多態性及等位基因與PCOS的多因素Logistic回歸分析

表9 TNF-α基因多態性及等位基因與PCOS的多因素Logistic回歸分析

3 討論

PCOS作為一種常見的內分泌代謝性疾病，其發病原因與多種因素有關，如遺傳、環境、雄激素、肥胖、炎癥因子等[8]，目前其發病機制是婦科疾病中研究的熱點問題之一。細胞因子是細胞信號分子，對正常妊娠發育有重要作用，任何表達數量或位置上的異常都可能影響滋養層-子宮內膜相互作用，從而導致妊娠并發癥。相關研究表明，PCOS為一種慢性炎癥性疾病，在肥胖型PCOS患者中，其血清IL-1β水平明顯提高，且MARTíNEZ-GARCíA[9]等研究提示，TNF-α及IL-6與胰島素抵抗密切相關，其中TNF-α與睪酮水平呈正相關性，而胰島素抵抗和高雄激素是導致PCOS發生的重要因素。應用傾向性評分匹配方法研究PCOS患者炎癥因子的基因多態性，可以在控制已知混雜因素的基礎上從遺傳學角度探討其發病機制，對于PCOS的診治有重要的意義。

IL-1基因家族在早期懷孕期間起著關鍵作用，其在卵巢局部被發現，與卵子的發育成熟、排卵以及受精卵的種植存在顯著的相關性[10]。本研究結果顯示，PCOS組IL-1β基因-511位點TT基因型及T等位基因頻率顯著高于對照組(P<0.05)，IL-1β基因-511C/T多態性很可能是PCOS發生的危險因素。考慮其原因為，炎癥因子IL-1β與肥胖相關，而高BMI是PCOS發生的重要危險因素。RASHID[11]等研究發現，IL-1β基因-511位點的T等位基因可促進IL-1β分泌；ROSTAMTABAR[12]等對60例PCOS患者研究發現，IL-1β基因-511位點攜帶T等位基因的患者有明顯發胖的風險。

TNF-α水平的升高與胰島素抵抗、糖耐量的下降顯著相關，而TNF-α中某些基因的多態性與TNF-α的分泌改變有關[13]。本研究顯示，TNF-α基因rs4645843位點CC基因型和C等位基因頻率顯著高于對照組(P<0.05)。多項研究表明，TNF-α基因rs4645843位點CC基因型是少數炎癥性疾病的關鍵標記物，其能提高血清內TNF-α水平，增加胰島素抵抗發生的風險[14]，且C等位基因頻率增高，將提高血液中甘油三酯和血糖水平，并導致卵泡細胞進一步分泌雄激素，抑制卵泡的發育成熟，影響正常卵泡組織的排卵[15-16]。因此，TNF-α基因rs4645843位點多態性可能是誘導PCOS發生的關鍵因素。

本研究用多因素Logistic回歸分析結果提示，IL-1β基因-511位點TT基因型及T等位基因是PCOS的發生的危險因素，TNF-α基因rs4645843位點TT基因型及T等位基因是抑制PCOS發生的保護因素。IL-1和TNF-α在生殖生理學中起著關鍵作用，包括卵泡成熟、排卵和植入，因此，要對上述基因多態性進行研究，以便更好地描述PCOS的風險因素。本研究結果顯示，IL-6基因rs4645843位點及TGFβ1基因-869位點多態性與PCOS的發生無顯著關聯性(P>0.05)。

綜上所述，IL-1β和TNF-α基因的遺傳變異與PCOS的發生具有相關性，但本研究納入樣本數量有限，具有一定局限性，且未對不同BMI數值的PCOS患者進行探究分析，故在后續的研究中，將繼續收集病例，并對所收集PCOS患者的BMI、血脂水平與IL-1β、IL-6、TNF-α及TGFβ1基因多態性的相關性進行探討分析。