棗種質資源有機酸組分及含量特征分析

趙愛玲，薛曉芳，任海燕，王永康，李登科，李 毅

(山西農業大學，山西省農業科學院 果樹研究所，果樹種質創制和利用山西省重點實驗室，太原 030031)

棗(ZizyphusjujubaMill.)是中國第一大干果樹種，品種資源豐富，據報道中國現有棗種質資源900多份[1]。棗果實除含有一般營養成分外，還含有黃酮、腺苷、有機酸、三萜、維生素和生物堿等多種生物活性物質[2-7]，營養價值極高。紅棗被譽為“藥食同源”的傳統營養滋補品，具有補氣血、益脾胃、潤膚養顏、抗衰延年等保健功效，倍受人們青睞。隨著生活水平的提高，人們對食品的追求已逐漸轉向具有合理營養和保健作用的功能性食品，越來越希望通過膳食獲得某些特殊功效。進一步確知不同種質資源果實的功效成分及其含量將為資源的高效利用和人們的膳食選擇提供理論基礎。

糖酸組分及其含量是決定果實風味品質的重要因素[8-11]。目前，關于果實糖酸研究的報道很多[12-13]，但對于棗果實有機酸組分的研究報道較少。孫延芳等[14]分析了陜北酸棗中的酒石酸、蘋果酸、檸檬酸等7種有機酸，同時建立了測定棗果中7種有機酸的 HPLC 分析方法。趙愛玲等[15]對20個棗品種中9種有機酸組分進行分析，初步明確了棗果有機酸組分的含量特征和在不同發育時期的含量變化。劉禎妍等[16]、侯麗娟等[17]也對幾個棗品種果實的有機酸進行了測定分析。2019年周曉鳳[18]對近年引進新疆的棗資源果實糖、酸組分進行了分析測定，基于酸組分含量，將種質資源果實酸積累劃分為蘋果酸積累型、奎寧酸積累型和中間型3類。已有關于棗果實有機酸研究的報道主要以方法和定性為主，對不同類型棗種質資源果實的有機酸組成和含量特征缺乏系統的分析，不能完全反映其在棗果實中的普遍規律，對種質資源多樣性也不能作客觀評價。因此，本研究擬通過對國家棗種質資源圃的219份棗種質資源果實的酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸7種水溶性有機酸組分的含量特征進行研究，揭示不同類型棗種質的有機酸組成存在的差異，為棗優良新品種的選育和不同用途的品種篩選提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

試驗于2017—2018年在山西省農業科學院果樹研究所進行，選取包括野生資源、地方品種和選育品種的219份種質資源果實為研究試材(表1)。樣品均采自國家棗種質資源圃，樣本樹為正常生長結果的成齡樹，栽培條件相同，管理水平 一致。

每份種質均在果實脆熟期選取3株樣本樹，從樹冠外圍不同方向取30～50個大小均勻無病蟲害的果實，采摘后當即清洗，切片，混勻后分3份分別裝入塑封袋，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.2 儀器方法

試驗采用超高效液相色譜法測定酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸7種水溶性有機酸組分的含量。檢測儀器為Waters公司UPLC ACQUITY H-Class超高效液相色譜儀，數據處理系統為Empower 2，選用ACQUITY TUV 紫外檢測器和ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm，2.1 mm×100 mm的酸分析柱。試驗所用標準品均為Sigma公司產品。液相分析用外標法定量，單標定性，混標定量。

提取和測定均參照劉禎妍等[16]、趙愛玲等[19]的方法。用0.02 mol·L-1KH2PO4水溶液提取，取20 g冷凍果肉加80 mL提取液打漿，漿液在室溫條件下超聲提取20 min，先用4層紗布粗濾，濾液 10 000 r·min-1離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜后上機分析。檢測流動相為甲醇和 0.02 mol·L-1的KH2PO4水溶液(H3PO4調至pH 2.38)梯度檢測，檢測波長210 nm，流速 0.15 mL·min-1，柱溫35 ℃，進樣量5 μL。試驗結果以鮮質量計。

1.3 數據處理

采用Microsoft excel 2003和SPSS 18.0 對試驗數據進行處理。對219 份棗種質果實7種有機酸組分含量的范圍、中間值和分布情況進行統計分析；按各組分含量范圍的種質分布情況繪制直方圖，采用Shapiro-Wilk進行正態性檢驗，置信區間≥99%；聚類分析以奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸3種主要有機酸組分作為聚類指標，對數據進行標準化處理，選用系統聚類的方式分析，測量間距采用歐幾里德距離平方和進行測量，得出聚 類樹。

2 結果與分析

2.1 不同種質資源棗果實有機酸組分含量

以脆熟期果實分析219份不同棗種質資源有機酸組分及含量，詳見表1。

表1 棗種質果實有機酸組分含量Table 1 Components and contents of organic acids in jujube germplasm μg ·g-1

(續表1 Continued table 1)

(續表1 Continued table 1)

(續表1 Continued table 1)

(續表1 Continued table 1)

2.1.1 總酸 果實中總酸含量為8 298.20～ 33 098.94 μg·g-1，平均值15 847.51 μg·g-1，種質間變異系數為24.13%；含量低的種質有‘蒲城圓梨棗’‘韓國月初’‘韶關大棗’‘大荔晉棗’‘太谷鈴鈴棗’等品種，含量高的有‘伏脆蜜’‘衡陽珍珠棗’‘保德小棗’‘北京纓絡棗’‘聊城圓鈴棗’等。正態性檢驗結果表明(圖1)，219 份棗資源果實總酸含量符合正態分布(P=0.038>0.01)，79.00% 的種質含量在11 250～18 750 μg·g-1，含量在13 750～15 000 μg·g-1的頻率最高，占所測種質的18.70%，含量超過30 000 μg·g-1的有2份種質，含量小于10 000 μg·g-1的有5份種質。

2.1.2 奎寧酸和蘋果酸 奎寧酸含量為 1 511.00～23 271.39 μg·g-1，平均5 359.74 μg·g-1，變異系數是 61.61%。含量較低的種質有‘交城甜酸棗’‘南谷豐葫蘆棗’‘臨猗珍珠龍棗’‘韶關大棗’‘太谷鈴鈴棗’等品種，含量較高的有‘衡陽珍珠棗’‘聊城圓鈴棗’‘北京纓絡棗’‘樂陵無核小棗’‘保德小棗’‘官灘2號’等。正態性檢驗結果表明(圖1)，219 份棗資源果實奎寧酸含量不符合正態分布(P=0.000 7<0.01)，其峰度和偏度在所測組分中都最高。67.00% 的種質含量在3 000～6 000 μg·g-1，含量在 4 000～5 000 μg·g-1的頻率最高，占所測種質的28.31%，含量超過20 000 μg·g-1的有6份種質，15 000～20 000 μg·g-1的只有1份種質，10 000～15 000 μg·g-1的有2份種質。

蘋果酸含量為2 424.14～24 525.01 μg·g-1，平均值7 636.07 μg·g-1。變異系數為29.79%，是所測有機酸組分中最小的，說明蘋果酸在不同種質間的含量差異最小。蘋果酸含量較低的種質有‘官灘2號’‘濮陽核桃紋’‘樂陵無核小棗’‘聊城圓鈴棗’‘韓國月初’等品種，含量高的有‘伏脆蜜’‘溆浦香棗’‘溆浦圓棗’‘臨猗珍珠龍棗’‘吳縣水團棗’等。正態性檢驗結果表明(圖1)，219 份棗資源果實蘋果酸含量符合正態分布(P=0.158>0.01)，68.49% 的種質含量在 6 000～10 000 μg·g-1，含量在 7 000～8 000 μg·g-1的頻率最高，占所測種質的24.20%，含量超過12 000 μg·g-1的有4份種質，含量小于4 000 μg·g-1的有9份種質。

在所測219份棗種質的果實中，奎寧酸/蘋果酸的比值平均值是0.83，范圍是0.14～7.78。不同種質按比值可分為兩類。比值大于1的為奎寧酸優勢型，這類種質只占所測樣品的 9.58%，如‘聊城圓鈴棗’‘北京纓絡棗’‘樂陵無核小棗’‘官灘2號’‘衡陽珍珠棗’‘保德小棗’‘濮陽核桃紋’等。比值小于1的屬蘋果酸優勢型，所測 90.41%的種質都屬于蘋果酸優勢型，如‘臨猗珍珠龍棗’‘伏脆蜜’‘溆浦香棗’‘南谷豐葫蘆棗’‘溆浦圓棗’‘韶關大棗’‘交城甜酸棗’等。

2.1.3 酒石酸、檸檬酸和琥珀酸 酒石酸的含量為112.09～1 208.53 μg·g-1，平均347.60 μg·g-1，變異系數是41.68%。含量較低的種質有‘灌陽短棗’‘新鄭大棗’‘大荔耙齒棗’‘臨猗笨棗’‘溆浦砂糖棗’等，含量較高的有‘韓國月初’‘大荔干尾巴’‘滄縣屯子棗’‘巷莊小酥棗’‘夏津茶壺棗’等。正態性檢驗結果表明(圖1)，219 份棗資源果實酒石酸含量不符合正態分布(P=0.006<0.01)，含量為300～350 μg·g-1的頻率最高，占所測種質的20.54%，其次是含量為 250～300 μg·g-1，占18.72%。含量超過1 200 μg·g-1的只有1份種質，800～1 000 μg·g-1的有3份種質。

檸檬酸的含量為252.60～ 9 240.07 μg·g-1，平均1 880.96 μg·g-1，變異系數是 54.94%。含量較低的種質有‘韓國月初’‘中棗1號’‘稷山圓棗’‘灰團棗’‘新鄭紅2號’等，含量較高的‘臨猗珍珠龍棗’‘溆浦圓棗’‘大荔小圓棗’‘大荔疙瘩棗’‘南京鴨棗’等。正態性檢驗結果表明(圖1)，219 份棗資源果實檸檬酸含量符合正態分布(P=0.309>0.01)，61.18% 的種質含量在1 200～2 800 μg·g-1，含量在1 200～1 600 μg·g-1的頻率最高，占所測種質的19.63%，含量超過8 000 μg·g-1的只有1份種質，含量小于400 μg·g-1的有4份種質。琥珀酸的含量為24.60～3 387.23 μg·g-1，平均495.42 μg·g-1，變異系數是117.64%，是所測有機酸組分中最大的，說明琥珀酸在不同種質間的差異最大。琥珀酸含量較低的種質有‘彬縣酸疙瘩’‘贊皇大棗’‘新鄭灰棗’‘洪趙小棗’‘西營笨棗’等，含量較高的有‘獻縣圓小棗’‘溆浦圓棗’‘婆棗枝變1號’‘滄縣屯子棗’‘大荔耙齒棗’等。另有39份種質果實中未檢測到琥珀酸，如‘彬縣圓棗’‘交城端棗’‘成武冬棗’‘大荔知棗’‘洪趙十月紅’‘夏津茶壺棗’‘蒲城圓梨棗’等。正態性檢驗結果表明(圖1)，180份棗資源果實琥珀酸含量不符合正態分布(P=0.000 1<0.01)，含量在500.00 μg·g-1以下的占55.25%，在167.00 μg·g-1以下的頻率最高，占29.22%，含量在 2 000.00 μg·g-1以上的只有5份種質。

2.1.4 乙酸和富馬酸 乙酸的含量為33.38～ 1 263.33 μg·g-1，平均341.99 μg·g-1，變異系數為 75.08%，且只有128份種質果實中可檢測到。含量較低的種質有‘圓鈴1號’‘平陸棒槌棗’‘大荔圓棗’‘臨澤小棗’‘臨潼轱轆棗’等，含量較高的有‘臨黃1號’‘北京纓絡棗’‘寧夏大紅棗’‘棗莊小鈴棗’‘新鄭小圓棗’等。正態性檢驗結果表明(圖1)，128份棗資源果實乙酸含量符合正態分布(P=0.034>0.01)，54.68% 的種質含量在100～400 μg·g-1，含量在100～300 μg·g-1的頻率最高，占所測種質的37.50%，含量在400～800 μg·g-1的種質占26.56，含量在800～1 000 μg·g-1的有2份種質，含量超過1 000 μg·g-1的有4份種質。

富馬酸的含量相對較低，為4.47～65.21 μg·g-1，平均18.41 μg·g-1，變異系數是 45.96%。含量較低的種質有‘歷城串鈴棗’‘早板棗’‘梨棗變異’‘梅花小鈴棗’‘運城綿棗’等，含量較高的有‘巷莊小酥棗’‘新鄭紅2號’‘保德小棗’‘交城端棗’‘新鄭雞心棗’‘蒲城綿棗’等，只有‘新鄭雞蛋棗’未檢測到。正態性檢驗結果表明(圖1)，218份棗資源果實富馬酸含量不符合正態分布(P=0.003<0.01)，58.26% 的種質含量為 10～20 μg·g-1，含量為13.33～16.67 μg·g-1的頻率最高，占所測種質的23.85%，含量超過40 μg·g-1的只有4份種質。

2.2 棗果實有機酸的組成及占比

基于對219份種質棗果實的酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸7種有機酸組分測定的基礎上，分析棗果實有機酸的組成特點，結果表明(圖 2)：7 種有機酸組分中蘋果酸含量最高，占總酸的48.20%，其次是奎寧酸占總酸的33.38%，檸檬酸占總酸含量的11.87%，這3種酸占總有機酸的93.45%，說明棗果水溶性有機酸以蘋果酸、奎寧酸和檸檬酸為主。其他組分高低依次是琥珀酸3.13%、酒石酸2.19%、乙酸2.16%、富馬酸0.12%。

2.3 棗果有機酸組分的相關性分析

基于所測219份種質棗果實中的酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸7種有機酸組分進行相關性分析(表2)，發現總酸與奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸的相關系數分別為0.695、0.469、0.322、0.235、0.219，與奎寧酸的相關系數最大，說明奎寧酸的含量對果實的酸度影響最大，其次是蘋果酸和檸檬酸。奎寧酸與蘋果酸呈極顯著負相關，與檸檬酸呈顯著負相關，與富馬酸呈極顯著正相關。檸檬酸與蘋果酸、琥珀酸均呈極顯著正相關，與乙酸呈顯著正相關。

表2 有機酸組分的相關性分析Table 2 Correlation analysis of different components of organic acids

2.4 棗種質果實有機酸含量的聚類分析

對219份種質的蘋果酸、奎寧酸、檸檬酸3個主要有機酸組分進行系統聚類，結果見圖3。當聚類歐氏距離取值D=7.5時，可把219份種質分為5個類群。

第一類群總酸含量較低，均值為14 006.39 μg·g-1，蘋果酸、奎寧酸、檸檬酸3種有機酸的比例平均為6.5∶5.1∶1.1，包括70份種質，占所測種質的31.96%，又可分為3個組群，第一組群蘋果酸和檸檬酸含量相對較高，如‘八月炸’‘合陽鈴鈴棗’‘河北無核’‘魯棗4號’‘延川大白棗’等；第三組群蘋果酸和檸檬酸含量相對較低，如‘大荔干尾巴’‘韓國月初’；第二組群介于二者之間。

第二類群包括69份種質，占31.51%，總酸含量均值為18 186.32 μg·g-1，蘋果酸、奎寧酸、檸檬酸3種有機酸的比例平均為9.3∶5.1∶ 1.7，也可分為3個組群，第一組群奎寧酸含量相對較高，檸檬酸含量較低；第三組群蘋果酸和檸檬酸含量相對較高；第二組群介于二者之間。

第三類群也包括69份種質，總酸含量也較低，均值為14 636.02 μg·g-1，蘋果酸、奎寧酸、檸檬酸3種有機酸的比例平均為6.8∶4.2∶ 2.5，檸檬酸含量是第一類群的2倍多。3個組群中第一組群總酸含量相對較高，3種主要有機酸相互間的含量差異最大，且檸檬酸含量較高，均值為3 293.28 μg·g-1；第二組群3種主要有機酸相互間的含量差異最小，總酸含量也低；第三組群介于二者之間。

第四類群只包括‘大荔疙瘩棗’‘溆浦圓棗’‘臨猗珍珠龍棗’和‘伏脆蜜’4份種質，這類種質屬于蘋果酸優勢型的高酸種質，總酸均值為 27 310.42 μg·g-1，‘伏脆蜜’是所測種質中蘋果酸含量最高的，其他3個都是所測種質中檸檬酸含量較高的。

第五類包括‘保德小棗’‘北京纓絡棗’‘官灘2號’‘衡陽珍珠棗’‘樂陵無核小棗’‘聊城圓鈴棗’和‘穎玉’7份種質，均屬奎寧酸優勢型的高酸種質，總酸均值為27 890.04 μg·g-1，奎寧酸均值為21 134.83 μg·g-1。

3 討 論

3.1 棗果實中主要有機酸的組成

黃艷鳳等[20]用GC-MS法分析山東沾化、河北黃驊、天津靜海3個產地冬棗中的有機酸發現，各產地冬棗果肉中所含有機酸種類基本相同，但含量有所差異，3個產地冬棗中含量最高的都是檸檬酸。周曉鳳[18]用HPLC法對新疆冬棗的分析發現冬棗中的蘋果酸占比最高，其次是奎寧酸和檸檬酸。周曉鳳[18]是對新疆塔里木大學棗種質資源圃的種質果實有機酸進行分析，本研究是對山西太谷國家棗種質資源圃的種質果實有機酸進行分析，所選樣品中相同種質49份，其中46份種質果實的主要有機酸含量高低順序基本一致，3份種質果實最高含量的有機酸不同。測定‘彬縣黑疙瘩’、‘延川狗頭棗’是蘋果酸含量最高，奎寧酸次之，‘衡陽珍珠棗’是奎寧酸含量最高，蘋果酸次之，而周曉鳳[18]的結果正好與此相反。總之，同一種質由于地域、年度的不同所測定的有機酸結果不完全一致，這可能是土壤條件、氣候特征等外界因素的影響導致有機酸積累不一樣從而引起果實口感不同。另外，周曉鳳[18]研究136份供試材料中84%的棗種質資源果實中未檢測到琥珀酸與富馬酸，本研究中219份供試材料中只有‘新鄭雞蛋棗’未檢測到富馬酸，琥珀酸的種質檢出率也達到82.19%，除環境條件外，分析方法不同及樣品采集時期、采集方位等的不一致也會導致所測有機酸結果存在一定差異。

本研究所測定的結果與趙愛玲等[15]所測相同種質的研究結果相比除多檢測了乙酸和富馬酸2種有機酸外，酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸、山楂酸的測定結果都升高，琥珀酸比2016測定值低，但占絕對優勢的有機酸依然是蘋果酸為主，奎寧酸次之。這種差異除年度氣候條件、水肥管理等影響外可能還與試驗方法有關，2019的試驗從樣品采集、貯藏、前處理、提取、測定等過程都比2016年更加注意操作細節，檢測條件也進行進一步優化，使得UPLC檢測分離效果更好，研究者經驗更豐富對色譜結果的判斷更加準確。

3.2 不同種質有機酸組分的含量范圍的分布

本研究是對山西太谷國家棗種質資源圃的219份種質果實的酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸7種水溶性有機酸進行分析，總酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸都符合正態分布，酒石酸、奎寧酸、富馬酸、琥珀酸不符合正態分布。周曉鳳[18]2019年對新疆塔里木大學棗種質資源圃的136份種質果實的草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸和琥珀酸進行分析，發現酒石酸、奎寧酸、蘋果酸符合正態分布，檸檬酸不符合正態分布。這種分析結果的差異，除樣品檢測值的不同還與所測種質資源數量不等有關，一般樣本群體越大，分析結果越接近真實情況。

4 結 論

研究通過對219份棗種質果實7種有機酸組分的系統分析，明確了棗種質資源果實的主要有機酸組分，各組分的含量范圍以及不同含量種質的分布情況。按主要有機酸的組成以及總酸的含量，將所測種質分為5大類群，并篩選出一批蘋果酸優勢型的高酸種質和奎寧酸優勢型的高酸種質以及各有機酸組分含量高的種質和缺少某種有機酸的特異種質。為棗種質資源的高效合理利用提供了理論依據，也為進一步研究棗果各有機酸的合成機理提供基礎。