5種植物源農藥對食用菌生產中脈孢霉抑制效果研究

趙長江，代晨晨，范博文，張圣也，張海燕

(黑龍江八一農墾大學 農學院/黑龍江省秸稈資源化利用工程技術研究中心，黑龍江大慶 163319)

食用菌因其味美、營養、保健和藥用等多重用途[1-2]，尤其是可以不與糧食爭地的方式生產人類優質食品，而備受青睞。中國已成為食用菌生產和消費大國，安全的、規模化的食用菌產業對于保護農業生態環境，促進農業和環境可持續發展具有重要意義[3-5]。

但是，伴隨食用菌的規模化栽培，菌絲體培養和子實體培養階段時刻面臨“雜菌”的危害，成為產業發展的制約因素之一。“雜菌”與食用菌之間既可能是寄生關系，也可能是相互拮抗作用，還可能是一種相互競爭關系[6]。其中，鏈孢霉(Neurosporasitophila)和紅 色 面 包 霉(Neurosporaspp.)為典型的競爭性霉菌，在食用菌生產中普遍發生，具有范圍廣、來勢猛、繁殖快、防治難、損失大的特點[7-8]。目前，物理預防和化學防治措施相結合仍是食用菌生產中脈孢酶類“雜菌”治理常用方法。物理防治主要涉及菌種的選擇、原材料的配比、室內外常規消毒、控制培養溫濕度等；化學防治主要使用多菌靈、生石灰等粉劑拌料或使用二氯異氰尿酸鈉熏蒸消毒[9-12]。但由于過量化學農藥會在食用菌產品中有所殘留、影響產品質量并且會危害人體健康[13]。因此，選用高效的生物農藥作為替代品，是實現綠色安全生產的有效措施之一。

植物源農藥又稱植物性農藥，是指利用植物體內參與自身防御反應的次生代謝產物不利于有害生物的特性而開發利用的藥劑，例如對昆蟲具有拒食、毒殺、麻醉、抑制生長發育及干擾正常行為的，或是對多種病原菌及雜草具有抑制作用的次生代謝物[14]。植物源農藥具有環境友好、生物活性多樣、對非靶標生物安全、不易產生抗藥性等優勢[15-16]。截至2019年底，中國在登記有效期內的植物源農藥共計28種，其中苦參堿單劑的登記數量最多，占農用植物源農藥品種登記單劑數量的45%[17]。苦參堿對人畜低毒，是廣譜殺蟲劑，具有觸殺和胃毒作用[18]，與蛇床子素一樣具有殺蟲和抑菌的雙重作用。前期有研究指出，植物提取物對木霉(Trichodermaspp.)、青霉(Penicillium)和脈孢霉(Neurospora)等食用菌的競爭性雜菌孢子萌發存在明顯抑制作用[19]，但是關于植物源農藥在食用菌生產中“雜菌”治理應用的報道，十分有限。

本研究從被污染的香菇栽培料中分離并鑒定出脈孢霉菌，選取印楝素、苦參堿、丁子香酚、蛇床子素、乙蒜素5種植物源農藥通過藥劑平板法探討其對脈孢霉菌落生長的影響，以期為食用菌生產上的生物防治提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和藥劑

脈孢霉菌株分離于黑龍江省大慶市春雷農場被污染的香菇栽培料，在無菌操作臺中用消毒接種鉤輕輕刮取發病部位的霉層，接種到PDA培養基，置于28 ℃恒溫培養箱培養24 h；再取邊緣菌絲純化培養，連續純化兩代后置于4 ℃冰箱保存，備用。

供試5種植物源農藥分別為：印楝素，0.3%乳油，農藥登記號PD20101580，成都綠金生物科技有限責任公司；苦參堿，1.3%水劑，農藥登記號PD20121488，恒源偉業生物科技；丁子香酚，0.3%可溶液劑，農藥登記號PD20120949，南通神雨綠色藥業有限公司；蛇床子素，1%水乳劑，農藥登記號PD20150150，內蒙古清源寶生物科技有限公司；乙蒜素，80%乳油，農藥登記號PD20101285，河南省大地農化有限責任公司。

1.2 脈孢霉DNA的提取及分子鑒定

將供試脈孢霉接種到PDA液體培養基，28 ℃，120 r/min搖床培養2 d，用吸水紙吸干水分的新鮮菌絲通過CTAB法提取菌絲基因組DNA[20]。然后通過ITS1和ITS4通用引物對DNA進行PCR擴增，擴增條件為94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環。PCR產物經電泳檢測后送華大測序，并提交NCBI數據庫進行序列比對分析。PCR擴增及測序引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。

1.3 脈孢霉溫度響應生長試驗

將PDA活化菌株用8 mm打孔器打成大小一致的菌塊，接入90 mm培養皿的培養基中央，分別置于10個不同溫度梯度下恒溫培養24 h，用十字交叉法測菌落直徑，設3個重復。溫度梯度分別為5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃，以28 ℃為對照。

菌絲生長速度=(菌落半徑-打孔器半徑)/時間。

1.4 植物源農藥抑菌作用測定

將PDA培養基定量分裝于100 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min，水浴鍋緩慢冷卻至60 ℃時，分別加入50倍、100倍、300倍、500倍、1 000倍、2 000倍稀釋的供試農藥，充分混勻倒入90 mm培養皿中，制成不同濃度的藥劑平板，以清水添加為對照。

選擇PDA培養基活化菌株用8 mm打孔器制備接種菌碟，接入藥劑平板，置于28 ℃恒溫培養24 h，采用十字交叉法測菌落直徑，設3個重復。其中抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-打孔器直徑)×100%。

1.5 數據統計分析

利用Microsoft Excel 2003軟件對試驗數據進行匯總，運用DPS 7.05統計軟件Duncan’s新復極差法比較不同處理間的差異顯著性，并計算各供試藥劑的毒力回歸方程、相關系數r值和EC50值。

2 結果與分析

2.1 脈孢霉的分子鑒定及其菌絲最適生長溫度

以純化菌株基因組DNA為模板，ITS1和ITS4擴增特異PCR產物直接測序獲得600 bp堿基序列，提交NCBI數據庫進行比對(表1)，匹配112條錘舌菌綱真菌序列，發現與好食脈孢霉菌(Neurosporasitophila)株M21的18S核糖體RNA基因序列的完全匹配，期望(Expect)值為0.0、一致性(Identities)為100%、缺口(Gaps)為0%，表明供述菌株為好食脈孢霉(N.sitophila)。將脈孢霉置于10個不同溫度下培養24 h，不同溫度下菌絲生長速度差異顯著(圖1)。在5 ℃和 45 ℃時停止生長，在二者區間內均可生長；在 10 ℃和15 ℃雖能生長但菌落生長緩慢，生長速率分別為3 mm/d和5.7 mm/d，48 h后菌落直徑變化不大，同時產生少量橘紅色分生孢子；30 ℃和35 ℃處理及28 ℃對照培養的脈孢霉在接種24 h后已經長滿培養皿，28～35 ℃為該菌最適生長溫度區間；25 ℃和40 ℃下脈孢霉生長速率相當，為28 mm/d左右。結果表明，脈孢霉生長溫度范圍較廣、喜高溫，最適生長溫度為28～35 ℃。

表1 測序脈孢霉ITS序列比對結果Table 1 ITS sequence alignment of the tested Neurospora strain

2.2 印楝素對脈孢霉菌絲生長的影響

0.3%印楝素乳油分別稀釋至50倍、100倍、300倍、500倍、1 000倍和2 000倍的藥劑平板對脈孢霉的抑制率差異不同(圖2)。隨處理藥劑濃度的升高，菌落直徑減小，抑制率增強。其中，印楝素乳油2 000倍和1 000倍平板與對照相同，抑菌率為0；500倍平板抑菌率55%，與對照差異顯著；100倍和50倍平板(3 mg/kg)抑菌率達100%，菌絲僅在菌碟上生長，生長緩慢且為絮狀，48 h后仍有粉紅色孢子產生。

2.3 苦參堿對脈孢霉菌絲生長的影響

1.3%苦參堿水劑分別稀釋至50倍、100倍、300倍、500倍、1 000倍和2 000倍的藥劑平板對脈孢霉的抑制率有差異(圖3)。隨藥劑處理濃度的升高，菌落直徑減少，抑制率增強，均與對照差異顯著。其中，苦參堿水劑2 000倍平板抑菌率為24%，1 000倍(13 mg/kg)抑制率為63%，50倍平板抑菌率近100%。

2.4 丁子香酚對脈孢霉菌絲生長的影響

0.3%丁子香酚可溶劑分別稀釋至50倍、100倍、300倍、500倍、1 000倍和2 000倍的藥劑平板對脈孢霉的抑制率相近(圖4)，2 000倍平板(1.5 mg/kg)時抑制率達到95%，其余供試濃度藥劑抑菌率均為100%。

2.5 乙蒜素對脈孢霉菌絲生長的影響

將80%乙蒜素乳油分別稀釋至50倍、100倍、300倍、500倍、1 000倍和2 000倍，供試6個濃度藥劑平板抑菌率均為100%，與對照間差異顯著(圖5)。乙蒜素乳油2 000倍濃度(400 mg/kg)抑制效果也相當明顯，菌碟上的菌絲在24 h后萎縮 死亡。

2.6 蛇床子素對脈孢霉菌絲生長的影響

1%蛇床子素水乳劑分別稀釋至50倍、100倍、300倍、500倍、1 000倍和2 000倍的藥劑平板對脈孢霉的抑制率不同，與對照差異顯著(圖6)。隨處理藥劑濃度的升高，菌落直徑減小，抑制率增強。其中，蛇床子素水乳劑2 000倍平板抑菌率為63%，500倍(20 mg/kg)及更低倍數平板抑菌率均超過90%，但在48 h后仍有粉紅色分生孢子產生。

2.7 植物源農藥對脈孢霉的毒力分析

依據供試農藥對菌絲的抑制數據，計算藥劑的毒力回歸方程、相關系數(r)和半最大效應濃度(EC50)。由表2可見，丁子香酚和乙蒜素對脈孢霉的抑制作用最強，其回歸曲線相關系數和EC50值均為0；其次是印楝素和苦參堿，印楝素回歸曲線的相關系數為0.974 4和苦參堿(0.973 5)相差不大，二者的EC50也相差不大；蛇床子素回歸曲線的相關系數為0.884 1，其EC50為 5.329 8。供試5種植物源藥劑對脈孢霉的毒力分別為乙蒜素=丁子香酚>印楝素>苦參堿>蛇床子素。

表2 供試植物源農藥對脈孢霉的毒力Table 2 Toxicity of the tested phytogenic pesticides to Neurospora

3 結論與討論

按照植保理論，抗性品種的應用是最理想的，但是食用菌抗性品種開發十分有限[21]，所以目前食用菌工廠化生產中病蟲害的防治仍以物理、化學防治為主。本研究從北方香菇分離鑒定一株脈孢霉屬真菌后，側重分析5種植物源農藥對脈孢霉菌絲生長的抑制作用。其中丁子香酚和乙蒜素對其抑制率最高，抑菌效果最好，可用于食用菌生產中脈孢霉的生物防治，或可與前期對脈孢霉防治化學藥劑[22-23]相結合提高防效。丁子香酚注冊登記為殺菌劑，近來有研究表明丁子香酚可抑制蘋果斑點落葉病菌(Alternariamali)和腐爛病菌(Valsamali)菌絲生長，用于蘋果病害防治[24-25]，本研究結果亦表明該單劑具有明顯的廣譜性。也有研究表明，在相等劑量下，大蒜素對番茄葉霉菌的防治效果高于多菌靈和甲基托布津，表明大蒜素是一種可以替代化學藥劑防治葉霉病的有效抑菌物質[26]，或是與40%福星乳油和70%甲基托布津等化學農藥配合施用防治脈孢霉等真菌危害[27]，并能提高速效性，取得經濟效益和生態效益雙豐收。此外，植物源農藥中藜蘆堿對黑腹果蠅卵和幼蟲的生物活性最高，而苦參堿對成蟲的殺蟲活性高，兩種藥劑在食用菌害蟲防治中均具備較好的應用前景[28]，本研究中苦參堿也具有一定的抑菌活性，表明植物源農藥具有病、蟲兼防的廣譜性，有助于食用菌減藥增效的綠色產業發展。

已有研究[29]表明，除蟲菊素和印楝素對平菇(Pleurotusostreatus)菌絲生長抑制率極低，可安全用于拌料栽培防治平菇害蟲。當然也有研究[30]表明，植物源農藥對木耳(Auriculariaauricula)菌絲具有明顯的抑制作用，且抑制率均隨稀釋倍數的增大而降低，其中印楝素對木耳菌絲的抑制率最高，苦參堿和除蟲菊素其次。盡管植物源農藥應用于食用菌生產尚存在一定限制，但是基于經濟和生態效益綜合考慮，可以充分利用植物源農藥對光不穩定和活性成分易分解等弱點[15-16]，探討錯期或錯環境應用植物源農藥。當然，食用菌菌絲生長以及子實體的形成都極易受外源物的影響，國家己登記且能夠用在食用菌生產上的殺菌劑較少，本研究試驗只限于室內，今后可將篩選出的藥劑在生產上進行驗證并分析食用菌中的藥劑殘留，明確供試藥劑對食用菌的高效性與安全性。