青稞耐低氮相關類甜蛋白基因HvTOND1克隆和亞細胞定位研究

安立昆，姚有華，姚曉華，吳昆侖

(1.青海大學 農林科學院，西寧 810016；2.青海省青稞遺傳育種重點實驗室，西寧 810016；3.國家麥類改良中心青海青稞分中心，西寧 810016)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)，也稱裸大麥，是最具有高原地區特色的重要糧食和飼料作物，青稞栽培歷史悠久是高原農業文明的象征。通過長期的進化和栽培選育青稞完全適應了高原地區極端的氣候，具有耐高寒、干旱、鹽堿、貧瘠等特點[1]。青稞籽粒富含纖維素、蛋白質、維生素、β-葡聚糖，是人類非常理想的健康食品[2]。在高原地區青稞的產業發展直接影響著高原地區的糧食安全和經濟發展，尤其是在高原農牧民扶貧、脫貧工作中有著重要的地位[3-4]。

氮元素是作物生長發育中最重要的大量元素，在植物三大營養素(氮磷鉀)中排第一，也是作物生長和產量的主要限制因素之一[5]。青稞的主要產地都在生態極為脆弱的高原地區，對農業生產中過量的氮肥施用引起的生態環境問題更為敏感，高原地區農業生態環境的可持續發展直接影響著生態環境保護和地區經濟發展。耐低氮基因TOND1(Tolerance of nitrogen defificiency 1)屬于類甜蛋白基因家族。類甜蛋白是植物中一類抗菌蛋白的總稱，屬于病程相關蛋白PR-5家族參與植物應對多種病害，尤其是對真菌病害的防御過程[6-8]。水稻耐低氮基因OsTOND1是由Zhang等[9]采用秈稻‘特青’為背景的云南元江野生稻滲入系為材料，通過苗期和全生育期的耐低氮性狀鑒定，并選用苗期對低氮敏感滲入系‘YIL105’與‘特青’雜交構建次級定群體進行精細定位克隆得到的一個水稻類甜蛋白基因，發現其主要在水稻新生的芽、根、莖、幼嫩葉片和幼穗中表達，采用洋蔥表皮進行亞細胞定位研究發現其定位在細胞膜中，在水稻中過表達OsTOND1能提高水稻苗期耐低氮能力和大田成熟期的產量，采用RNAi干擾水稻中OsTOND1基因表達發現低氮條件下水稻苗期的根長、株高、干質量、氮濃度和植株總氮量和大田成熟期的有效穗數、每穗實粒數以及單株產量都明顯下降，進一步研究發現OsTOND1啟動子區3個SNP和編碼區的2個SNP是含有TOND1基因的水稻品種耐低氮性增強的原因。

近年來各界高度重視化肥減施增效的研究與推廣，化肥減施增效戰略在高原地區生態文明建設有著重要的地位，減少高原地區農業生產中化肥施用，減少農業生產對環境的影響對于保護高原地區農業生態環境促進經濟可持續發展具有重要作用。克隆和研究青稞耐低氮基因對研究青稞耐低氮機制以及利用分子育種技術培育耐低氮青稞品種有重要的推動作用，對于減少青稞生產中的氮肥施用，減少農業生產對生態環境的影響。促進青稞栽培區域的生態農業可持續發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.2 試驗方法

1.2.1 青稞DNA提取 參照天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒DP305說明書提取青稞葉片基因組DNA，提取的DNA放于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2HvTOND1基因克隆和啟動子區域序列克隆 根據已報道的水稻耐低氮基因OsTOND1，將基因序列輸入植物基因組數據庫Gramene(http://www.gramene.org/)中大麥基因組數據中進行搜索獲得大麥的HvTOND1基因，并根據大麥HvTOND1基因序列及起始密碼子ATG前2 000 bp左右序列設計引物。基因克隆正向引物：F:5′-ACAGCACCACAGCAAGCAAG-3′；反向引物：R:5′-TCAGGGCGTGTGTCAAGGTT-3′。啟動子區域序列克隆正向引物：F:5′-TGTCGATCGTGAGGAGCTGG-3′；反向引物：F:5′-CTTGCTTGCTGTGGTGCTGT-3′。采由于用HvTOND1不具有內含子所以采用KOD-FX高保真PCR酶以青稞‘昆侖14’基因組DNA為模板克隆青稞HvTOND1序列和啟動子區域序列。對提取的青稞基因組進行PCR擴增，按以下程序進行擴增：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s,56 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min(擴增啟動子區域序列為2 min)，35個循環；4 ℃保存。反應完畢，取5 μL PCR產物在含EB的10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下檢測。將PCR產物與pEASY-Blunt Cloning載體混合參照試劑盒說明書進行連接并轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆并送測序。

1.2.3 青稞HvTOND1生物信息學分析 采用Gene Structure Display Server 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對基因結構進行分析；采用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對啟動子區域元件進行預測分析；采用Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)對蛋白理化性質進行預測分析；采用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對蛋白跨膜結構進行預測分析；采用kinasephos2(http://kinasephos2.mbc.nctu.edu.tw/)對蛋白磷酸化位點進行預測分析；采用SignalP(http://www.Cbs.Dtu.Dk /services /SignalP/)對蛋白信號肽進行預測分析；采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對蛋白二級結構進行分析；采用同源建模軟件Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/)進行蛋白三級結構同源建模。采用DNAMAN 7.0將青稞 HvTOND1蛋白序列與小麥(Triticumaestivum)TaTOND1、黑麥(Secalecereale)ScTOND1、小米(Setariaitalica)SiTOND1、水稻(Oryzasativa)OsTOND1、高粱(Sorghumbicolor)SbTOND1、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)BdTOND1、節節麥(Aegilopstauschiisubsp.tauschii)AtsTOND1、玉米(ZeamaysL.)ZmTOND1、二型花DoTOND1(Dichantheliumoligosanthes)、羊黍PhTOND1(Panicumhallii)的蛋白序列進行對比并采用MEGA7中以最大似然法構建系統進化樹。

1.2.4 青稞HvTOND1亞細胞定位研究 采用pBI221-GFP載體用于亞細胞定位研究，設計帶有XbaⅠ的正向引物：5′-GCTCTAGAACAGCACCACAGCAAGCAAG-3′和KpnⅠ酶切位點的反向引物5′-CGGGTACCTGGGCAGAA GACGACTTG-3′采用高保真酶KOD-FX擴增HvTOND1的ORF區域，構建C端與GFP融合的表達載體。PCR擴增體系與HvTOND1基因克隆時體系相同。PCR產物和PBI221-GFP載體質粒經KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切后，分別回收片段混合后采用T4連接酶連接后轉入大腸桿菌DH5α感受態中，選取陽性克隆，并進行測序 驗證。

將水稻種子在30 ℃黑暗萌發15 d取葉片切成碎段(<0.5 mm)，總量5～10 g。加入5～ 10 mL酶解液28 ℃ 100 r/min緩慢震蕩酶解 5～6 h，酶解后用40 μm濾網過濾，50 g離心 10 min。倒去上清，用預冷W5溶液10 mL洗滌2次，50 g離心5min，加入500 μL MMG溶液懸浮。鏡檢：40倍鏡下，每個視野20～40個。取200 μL原生質體懸液加入10 μL質粒(500 ng以上)，取相等體積的PEG溶液混合，室溫靜置 30 min。用1 mL W5稀釋原生質體，100 g離心 5 min去上清。加入1 000 μL W5洗1～2次。最后加入 1 mL W5溶液，轉移到2 mL 離心管中，28 ℃暗培養 24～48 h，激光共聚焦顯微鏡 觀察。

2 結果與分析

2.1 青稞 HvTOND1基因和啟動子區域序列 克隆

通過PCR分別擴增出片段大小為619 bp的基因片段和2 080 bp的啟動子區域片段(圖1)。將擴增得到的片段連接入pEASY-Blunt Cloning載體中采用M13引物進行測序。

2.2 青稞 HvTOND1基因生物信息分析

2.2.1 青稞HvTOND1啟動子功能元件預測 將克隆得到的HvTOND1基因啟動子區域序列輸入啟動子元件分析網站PlantCARE中進行分析(表1)。發現HvTOND1基因啟動子區域具有多種激素誘導表達元件。

表1 青稞 HvTOND1 啟動子區域元件分析 Table 1 Structure of cis-acting elements in promoter region of HvTOND1 gene

2.2.2 HvTOND1蛋白理化性質分析 通過在線軟件ProtParam分析OsTOND1和 HvTOND1蛋白的理化性質，OsTOND1由182個氨基酸組成，為疏水性穩定蛋白。HvTOND1由171個氨基酸組成，為親水性穩定蛋白(表2)。

表2 水稻OsTOND1和青稞 HvTOND1蛋白質理化性質分析Table 2 Physical and chemical properties of OsTOND1 and HvTOND1 protein

2.2.3 HvTOND1蛋白跨膜結構分析 通過在線軟件TMHMM Server v.2.0 網站 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)對OsTOND1和 HvTOND1蛋白跨膜結構分析發現OsTOND1有一個跨膜結構而HvTOND1不具有跨膜結構(圖2)。

2.2.4 HvTOND1蛋白磷酸化位點預測 使用KinasePhos(http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/predict.php)預測OsTOND1和HvTOND1的磷酸化位點，發現OsTOND1有絲氨酸(Ser)3個，蘇氨酸(Thr)2個，酪氨酸(Tyr)1個共5個磷酸化位點。HvTOND1有絲氨酸(Ser)1個，蘇氨酸(Thr)2個，酪氨酸(Tyr)1個共3個磷酸化位點(圖3)。

2.2.5 HvTOND1蛋白信號肽預測 采用在線軟件SignalP-5.0(http://www.Cbs.Dtu.Dk /services /SignalP/)，對 OsTOND1和HvTOND1進行分析發現OsTOND1具有信號肽序列：MASAPAASPAVLVVVVLVASLAAGGANA，切割位點在第28至29位氨基酸之間。HvTOND1具有信號肽序列：MAASSSMLILLLAAALDADA，切割位點在第20至21位氨基酸之間(圖4)。

2.2.6 HvTOND1蛋白二級結構預測分析 采用在線軟件SOPMA分析OsTOND1和 HvTOND1蛋白二級結構發現OsTOND1蛋白的α螺旋、無規則卷曲、β轉角、延長鏈分別占氨基酸總數的6.59%、50.55%、8.24%、34.62%。HvTOND1蛋白的α螺旋、無規則卷曲、β轉角、延長鏈分別占氨基酸總數的12.87%、54.97%、3.51%、28.65%(圖5)。

2.2.7 HvTOND1蛋白信號肽預測三級結構預測分析 采用在線軟件Swiss-Model對青稞HvTOND1和水稻OsTOND1蛋白進行同源建模生成三級結構(圖6)。

2.2.8 HvTOND1蛋白氨基酸序列對比分析 采用DNAMAN 7.0進行蛋白序列對比分析發現青稞HvTOND1與水稻OsTOND1一致性為58.24%，HvTOND1與其他物種的同源蛋白都具有信號肽和TLP-P結構域(圖7)。

2.2.9 HvTOND1同源進化分析 將青稞HvTOND1與小麥(Triticumaestivum)TaTOND1、黑麥(Secalecereale)ScTOND1、小米(Setariaitalica)SiTOND1、水稻(Oryzasativa)OsTOND1、高粱(Sorghumbicolor)SbTOND1、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、節節麥(Aegilopstauschiisubsp.tauschii)AtsTOND1、玉米(ZeamaysL.)ZmTOND1、二型花DoTOND1(Dichantheliumoligosanthes)、羊黍PhTOND1(Panicumhallii)的TOND1同源蛋白序列輸入MEGA7中構建系統進化樹，發現青稞HvTOND1與節節麥AtsTOND1親緣關系最近(圖8)。

2.3 青稞HvTOND1亞細胞定位結果

采用水稻原生質體進行亞細胞定位發現在水稻原生質體內質網中有明顯的綠色熒光信號，說明青稞HvTOND1定位于內質網中(圖9)。

3 結論與討論

HvTOND1屬于類甜蛋白家族(Thaumatin-like protein)，類甜蛋白廣泛分布于動植物和微生物中[10]。類甜蛋白家族在植物應對干旱、低溫、病害等逆境中均能發揮功能，尤其是具有廣譜抗真菌病害作用，此外類甜蛋白家族也廣泛參與植物的生長發育過程調控[11-13]。植物類甜蛋白家族基因有10個具有共同起源的旁系類群構成，不同類群的類甜蛋白家族基因的功能發生高度分化[14]。類甜蛋白家族大多具有信號肽結構，是一種分泌蛋白可以在細胞外發揮作用[13,14-18]。

目前，大部分類甜蛋白家族研究都主要集中于抗真菌病害等領域，很多類甜蛋白家族基因被應用于培育抗真菌病害的轉基因植物中[19]。目前，關于類甜蛋白在植物耐低氮中的功能研究報道極少。李健平等[20]采用race技術從香蕉EST文庫中克隆到一個與香蕉抗病相關的類甜蛋白基因MaTLP1，該基因在根、球莖、假莖中表達量高，在葉、花、果實中表達量較低，并且發現在香蕉受古巴專化型尖孢鐮刀菌感染時有強烈的誘導表達，認為該類甜蛋白在香蕉抗枯萎病中有重要的作用。馬驪等[13]采用雙向電泳結合質譜技術從低溫脅迫下的油菜葉片中差異蛋白點,分離出一個耐寒相關類甜蛋白，命名為TLP，并進一步對TLP進行生物信息學和低溫下的表達模式進行分析發現該類甜蛋白在油菜應對低溫脅迫中有著重要作用。一些研究表明從大麥、蘋果、櫻桃、煙草等植物中發現一些類甜蛋白具有β-1,3-葡聚糖酶活性，并認為這與誘導植物抵御真菌病害有關[21]。很多研究表明一些類甜蛋白家族成員有木聚糖酶抑制劑活性或淀粉酶抑制劑的活性，可以抑制昆蟲淀粉酶的活性，減少昆蟲消化吸收營養成分達到抵御蟲害的作用，此外很多植物中發現一些類甜蛋白家族成員是引起人類過敏的過敏源[14]。

目前，關于青稞中耐低氮相關類甜蛋白基因尚未見有研究報道，克隆和研究青稞HvTOND1對于研究青稞耐低氮分子機制具有重要意義。本研究根據已報道的水稻OsTOND1基因信息在植物基因組數據庫中進行搜索獲得了大麥的同源基因HvTOND1信息，并以此設計引物從青稞‘昆侖14’中克隆得到青稞HvTOND1基因序列信息。采用生物信息學軟件對基因和蛋白結構及理化性質等進行預測分析發現HvTOND1基因不具有內含子。啟動子區域上具有大量和激素有關的順式作用元件。很多類甜蛋白家族的表達受茉莉酸和水楊酸等激素信號調控[14,22]，HvTOND1基因啟動子區域序列元件預測也發現有8個茉莉酸和4個脫落酸的順式作用元件，1個水楊酸和2個赤霉素作用元件，此外還有4個MYB轉錄因子結合位點以及1個細胞周期和種子特異性順式作用元件。HvTOND1蛋白是一種分子量為18 022.24 u理論等電點為5.27的親水蛋白。HvTOND1具有4個磷酸化位點，具有信號肽結構，但是不具有跨膜結構。通過與其他物種的同源蛋白序列進行對比并構建系統進化樹發現其系統進化樹分成兩支小麥TaTOND1、小米SiTOND1、水稻OsTOND1、高粱SbTOND1、羊黍PhTOND1、二型花DoTOND1為一分支，玉米ZmTOND1、黑麥ScTOND1、二穗短柄草BdTOND1、節節麥AtsTOND1、青稞HvTOND1為另一分支，其中青稞HvTOND1與節節麥AtsTOND1親緣關系最近。亞細胞定位結果顯示青稞HvTOND1定位于內質網中，而張陽軍[23]研究發現水稻OsTOND1僅定位于細胞膜中。

青稞作為高原地區的特有作物，在青稞生產中避免過量施用氮肥造成對生態環境的破壞在生態極為脆弱的高原地區尤為重要。目前關于青稞中耐低氮基因的研究報道極少。本研究克隆了青稞耐低氮相關類甜蛋白基因HvTOND1，并進行生物信息學分析和亞細胞定位研究，為青稞耐低氮分子機制研究提供了一定的參考。