紫杉醇耐藥乳腺癌細胞外泌體來源的miR-5585-5p誘導乳腺癌細胞產生耐藥表型研究

魏欣宇，高 鵬，劉佳欣，王文銳，楊清玲，陳昌杰

據CA最新統計[1]，全球乳腺癌新發病例高達226萬，成為世界第一大癌癥，嚴重威脅了女性健康。乳腺癌的診斷和治療正在向個性化、精準化發展，如化療、內分泌治療和靶向藥物[2]。但目前面臨的重要問題是，乳腺癌耐藥性的產生和轉移常導致治療失敗和腫瘤復發[3]。因此，闡明乳腺癌細胞產生耐藥性的詳細機制對于尋找潛在治療靶點和乳腺癌早期診斷的生物標志物至關重要。外泌體作為一種運輸載體，大小在40～160 nm，在基質和癌細胞之間傳遞核酸和蛋白質，介導細胞間的通訊，從而影響癌細胞的生物活性。由于富含各種生物分子，外泌體為生物液體檢測提供了一種多組分診斷指標[4-6]。其中，microRNAs是內源性的小非編碼RNA，具有調節轉錄后基因表達的功能。生理過程和病理，包括癌癥、心血管和代謝性疾病都高度依賴miRNA。癌細胞釋放的外泌體miRNA可以介導腫瘤微環境中細胞的表型改變，促進腫瘤生長和耐藥。本研究主要探討外泌體源性miR-5585-5p的表達情況和其介導的耐藥機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 人乳腺癌細胞株SKBR-3購自中國科學院上海細胞研究所得，課題組前期成功構建紫杉醇耐藥細胞株SKBR-3/PR;胎牛血清、DMEM高糖培養基購自Hyclone公司;β-actin、P-GP、MRP 抗體購自Affnity;細胞凋亡試劑盒、BCA試劑盒購自碧云天公司；外泌體提取試劑盒購自貝貝生物科技有限公司；外泌體染料PKH26、PKH67購自上海宇玫博公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞培養在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中進行，置于5%CO2、37 ℃細胞培養箱中。待細胞融合度達到90%，胰酶消化離心進行傳代。

1.2.2 外泌體的提取 細胞融合度至50%，PBS清洗細胞，換無外泌體血清培養基繼續培養。收集細胞培養上清，利用超速離心法提取外泌體，根據外泌體提取試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 外泌體攝取實驗 以PKH26標記外泌體，根據說明書配制熒光染料，與提取的外泌體共孵育10 min，再與SKBR-3細胞共培養8 h，熒光顯微鏡觀察并拍攝。

1.2.4 轉染miR-5585-5p抑制劑 將乳腺癌耐藥細胞接種至六孔板中，放入 5% CO2、37 ℃培養箱中培養 24 h，當細胞融合度達到 50%～70%，棄掉舊培養基，PBS清洗后實驗組每孔分別加入1.5 mL 無血清培養基和500 μL配制的轉染試劑(A液：250 μL Opti-MEM+5 μL Lipofectamine2000;B液：250 μL Opti-MEM+5 μL inhibitor；靜置5 min后，B液加入A液，室溫孵育20 min)。

1.2.5 qRT-PCR檢測核酸表達量 從細胞和外泌體中提取總RNA(Trozal法)，逆轉錄獲得cDNA后進行PCR擴增。GAPDH作為內參，所用的引物序列見表1。qRT-PCR反應參數為 95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，55個循環。獲得的數據運用2-ΔΔCt計算表達量。

1.2.6 Western blotting檢測目的蛋白表達量 收集細胞，洗滌后加入裂解液冰上裂解30 min，離心后獲得總蛋白。BCA法測定總蛋白濃度。配制10%SDS-PAGE進行電泳，70 V電泳至濃縮膠和分離膠交界處，調整電壓100 V電泳至溴酚藍條帶到達分離膠底部，停止電泳；轉膜時將PVDF膜預先放入甲醇中激活，200 mA轉膜2 h;隨后將PVDF 膜放入封閉液中搖床孵育2 h，洗膜(每次10 min，3次)，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜，第2天孵二抗(37 ℃，2 h)，洗膜后曝光。

1.2.7 Transwell檢測細胞遷移能力 待細胞處于對數生長期，胰酶消化后，用無血清培養基重懸細胞并計數。按照實驗分組，各組上室加入含有相同細胞數(4×104/孔)的細胞懸液，并用無血清培養基補至200 μL;下室加入 600 μL含10% 胎牛血清的培養基，5% CO2、37 ℃培養箱中培養24 h。取出Transwell小室，用棉簽小心擦去上室的培養基以及膜上部未穿過的細胞，4%多聚甲醇固定20 min，結晶紫染色20 min，PBS清洗3次，自然晾干后，倒置顯微鏡隨機計數5個高倍鏡視野下細胞數目并拍照記錄。

1.2.8 細胞凋亡實驗 將細胞接種在6孔板中，5% CO2、37 ℃的培養箱中孵育。細胞密度達到80%時按照實驗分組處理，繼續孵育24 h。用不含EDTA 的胰酶將細胞消化后離心(1 000 r/min)5 min，預冷的PBS洗滌細胞 2 次。200 μL Binding Buffer重懸細胞，先加入5 μL FITC，再加入10 μL PI，染色后室溫避光孵育30 min，300目尼龍網過濾細胞懸液，上機檢測細胞的凋亡情況。

1.3 統計學方法 采用t檢驗。

2 結果

2.1 耐藥細胞源性外泌體被乳腺癌細胞攝取 外泌體攝取實驗表明PKH26標記的紅色外泌體能夠被乳腺癌細胞攝取至胞內(見圖1)。

2.2 耐藥細胞源性外泌體促進乳腺癌細胞產生耐藥表型 將從耐藥細胞上清液中提取的外泌體與乳腺癌親本細胞共培養。qRT-PCR結果顯示，相對于乳腺癌親本細胞，耐藥細胞外泌體共培養組的耐藥標志物表達均升高(P<0.01)(見表2)。Transwell 和細胞凋亡實驗結果表明，與乳腺癌親本細胞組相比，耐藥細胞外泌體共培養組的乳腺癌細胞遷移能力增強(P<0.01)，癌細胞凋亡率下降(P<0.01)(見圖2～3、表3)。

表2 在外泌體共培養組中耐藥相關基因表達水平升高

表3 耐藥細胞源性外泌體對乳腺癌細胞遷移能力和凋亡的影響

2.3 miR-5585-5p在耐藥細胞株及其外泌體中高表達 與乳腺癌細胞表達量(1.00±0.00)相比，miR-5585-5p在耐藥細胞中表達(2.08±0.35)明顯升高(t=5.35，P<0.01)；同時，分別從SKBR-3和SKBR-3/PR細胞中提取外泌體，經qRT-PCR驗證，紫杉醇耐藥的乳腺癌細胞外泌體中miR-5585-5p的表達量升高[(1.00±0.00)vs(3.03±0.49)](t=3.56，P<0.05)。

2.4 miR-5585-5p抑制劑逆轉乳腺癌耐藥細胞的耐藥性 在耐藥細胞中，與未轉染抑制劑的control組相比，miR-5585-5p inhibitor組耐藥性降低(P<0.01)，耐藥相關蛋白PGP和MRP表達下調(P<0.01)，抑制劑組遷移能力減弱(P<0.01)，細胞凋亡增多(P<0.01)(見圖4～6、表4)。

表4 miR-5585-5p抑制劑抑制乳腺癌耐藥細胞耐藥指標的比較

2.5 miR-5585-5p通過外泌體進入到乳腺癌細胞中 外泌體示蹤實驗證實，與對照組相比，實驗組CY3標記的miR-5585-5p通過外泌體進入到乳腺癌細胞內(見圖7)。

2.6 外泌體差異表達miR-5585-5p生物學活性分析 相對于未轉染抑制劑的外泌體共培養組，抑制劑外泌體組親本細胞的耐藥相關基因PGP、BCRP和MRP的表達量降低(P<0.01)，遷移能力降低(P<0.01)并誘導細胞凋亡(P<0.01)(見圖8～9、表5)。

表5 外泌體差異表達miR-5585-5p生物學活性指標的比較

3 討論

盡管乳腺癌的篩查、診斷和治療取得了進展，但乳腺癌的轉移和復發仍然存在并困擾著人們。在芳香化酶抑制劑抗性細胞中，Ⅱ型角蛋白拓撲關聯域經過表觀遺傳重編程，導致角蛋白-80上調，進而增加黏附，促進癌細胞侵襲[7]。耐藥通常伴隨著癌癥的復發和轉移而出現。乳腺癌細胞來源的外泌體能夠促進乳腺癌骨轉移，與通過轉移miR-21到破骨細胞形成轉移前生態位有關[8]。microRNAs可以調節蛋白表達，在生長和化療耐藥性中發揮作用。此外，外泌體通過與目標細胞膜的融合啟動細胞與細胞之間的通信，傳遞包括miRNAs和蛋白質在內的功能分子。PAN等[9]證實，miR-221-3p在ADR耐藥MCF-7細胞衍生外泌體中過表達可通過PI3K/AKT信號通路促進ADR敏感MCF-7(MCF-7/S)細胞的ADR耐藥。CHEN等[10]證實吉非替尼敏感細胞中miR-7的表達明顯高于吉非替尼耐藥細胞。外泌體從敏感細胞向吉非替尼耐藥細胞傳遞高表達的miR-7，逆轉吉非替尼耐藥。而且，miR-7的高表達與肺癌病人對吉非替尼治療的強響應和較長的生存時間有關。SANTOS等[11]對miR-155的功能測定與耐藥細胞的外泌體轉移到受體敏感細胞中相對應說明外泌體可能部分通過miR-155的外泌體轉移介導了對敏感細胞的抗性和遷移能力。

本研究首先從紫杉醇耐藥乳腺癌細胞中提取外泌體，并將其與乳腺癌親本細胞共培養，結果發現耐藥細胞分泌的外泌體能夠促進親本細胞產生耐藥表型。通過外泌體miRNAs測序分析發現其中miR-5585-5p在耐藥細胞株和其外泌體中表達均升高。因此，在后續實驗中，以耐藥細胞SKBR-3/PR為研究對象，抑制miR-5585-5p的表達發現miR-5585-5p抑制劑能逆轉耐藥細胞的耐藥性，抑制耐藥細胞遷移并誘導其凋亡。隨后，對miR-5585-5p進行標記后發現其通過外泌體進入到親本細胞內，提取轉染抑制劑組的外泌體，與未轉染抑制劑組相比，抑制劑組乳腺癌細胞的耐藥性降低，遷移能力降低，而細胞凋亡增多。

綜上，耐藥細胞可能通過外泌體遞送其產生的大量miR-5585-5p至親本細胞，并誘導親本細胞產生耐藥表型。但其中具體的機制和外泌體miR-5585-5p作為臨床乳腺癌腫瘤標志的可行性還需進一步研究。