膠體金免疫層析法快速檢測CRE碳青霉烯酶的效果評價

李 靜，耿志軍，鄭 晶，王 濤，應沖濤，郭 普

碳青霉烯耐藥腸桿菌科細菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae,CRE)的臨床分離率不斷增加，其治療已成為我國抗感染治療的嚴峻問題。產碳青霉烯酶是CRE最重要的耐藥機制之一[1]。目前，研究發現碳青霉烯酶主要包括A類酶(KPC)、B類酶(IMP、NDM及VIM等)及D類酶(OXA-48)[2]。臨床試驗證明新型β-內酰胺類/β-內酰胺酶抑制劑復合物等抗生素對大多數產A類和D類酶CRE菌株有效，但對B類酶無效。因此，區分CRE產酶類型對合理選擇抗生素及臨床治療具有重要意義。目前，臨床實驗室檢測碳青霉烯酶的方法主要有紙片協同試驗、mCIM(modified carbapenem inactivation method)和eCIM(EDTA-carbapenem inactivation method)聯合實驗、改良Hodge實驗、顯色培養和基因檢測方法等。其中mCIM和eCIM聯合實驗室目前臨床使用較多的碳青霉烯酶檢測方法[3]。但該實驗需要兩階段的孵育培養，結果時效性較差，且無法準確給出酶的分型結果。膠體金免疫層析法是最新研發的碳青霉烯酶快速檢測方法，該法將5種碳青霉烯酶的單克隆抗體與膠體金偶聯，并固定于醋酸纖維素膜上,用于培養后獲取的細菌樣本中碳青霉烯酶的體外定性檢測。本研究以蚌埠醫學院第一附屬醫院所收集的CRE菌株為研究對象，通過膠體金免疫層析法檢測CRE菌株的產碳青霉烯酶類型，并與基因檢測結果進行一致性分析，評估分析膠體金免疫層析法在CRE產碳青霉烯酶類型檢測中的應用效能。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集蚌埠醫學院第一附屬醫院2017年7月至2020年12月期間臨床分離的腸桿菌科細菌，對厄他培南、亞胺培南耐藥，剔除同一病人同一部位分離的腸桿菌科菌株，共收集細菌80株；另外收集對碳青霉烯類抗生素敏感的腸桿菌科細菌作為對照菌株，共計21株。

1.2 主要儀器與試劑 凝膠成像儀(Bio-Rad公司)、PCR 擴增儀(Applied Biosystems公司)、冷凍高速離心機(Thermo Fisher Scientific公司)、干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司)、哥倫比亞血瓊脂平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司)、西班牙瓊脂糖(Biowest)、GeneGreen核酸染料(北京天根生化科技有限公司)、2×Taq PCR Mix(北京天根生化科技有限公司)、Trans2K DNA Marker(北京全式金生物)、碳青霉烯酶基因PCR引物自上海生工生物合成、 1×TBE 緩沖液(北京天根生化科技有限公司)、亞胺培南紙片(10 mg，OXOID公司)、細菌培養箱(Thermo Fisher Scientific公司)、生物安全柜(力康生物醫療科技控股有限公司)、含珠菌種保存管(珠海貝索生物技術有限公司)、碳青霉烯酶檢測試劑盒(長沙中生眾捷生物技術有限公司)、渦旋儀(合肥艾本森科學儀器有限公司)。

1.3 PCR檢測方法 將保存的菌株接種到血瓊脂平板上，在37 ℃、5%CO2細菌培養箱內隔夜培養進行復蘇。采用加熱煮沸法提取細菌DNA模板，采用10 μL接種環挑取一環細菌，置于1 mL無菌去離子水中，于干式恒溫器中煮沸10 min，離心12 000 r/min，10 min，將含DNA的上清液轉移至新EP管中，待進行PCR檢測。本實驗檢測5個常見的碳青霉烯酶基因，基因種類及引物序列見表1，擴增條件和PCR反應體系參考文獻[4]設計。PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，100 V，30 min，于凝膠成像儀中曝光并拍照。

表1 PCR引物序列表

1.4 膠體金免疫層析法檢測 膠體金免疫層析法檢測CRE碳青霉烯的方法參照試劑盒說明書進行，將碳青霉烯酶檢測卡盒和提取緩沖液平衡至室溫。于EP管中加入150 μL提取緩沖液，使用1 μL接種環取一環細菌樣本置于含提取緩沖液的EP管中。樣本使用渦旋儀混合震蕩5 s使標本混合均勻(如果樣本黏稠，震蕩3 min并室溫靜置10 min后進行檢測)。取100 μL樣本混合液，加入檢測卡盒的樣本孔中，室溫放置15 min，讀取結果。試劑檢測結果解釋：(1)陰性結果，僅在C線區域出現一條紅線，則樣本中不含所測5種碳青霉烯酶或含量低于檢測線，判讀為陰性結果。(2)陽性結果，在C線區域中出現一條紅線并且在K、O、V、I、N檢測線區域中出現一條或多條紅線，判讀為陽性結果，樣本中含有一種或多種碳青霉烯酶。(3)無效結果，在C線區域未出現紅線，則測試結果無效。

1.5 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行分析。以PCR檢測結果為標準，計算膠體金免疫層析法的敏感性、特異性，Kappa值>0.750，說明一致性程度較好。

2 結果

2.1 臨床分離CRE菌株分布 101例臨床分離的腸桿菌科細菌，主要來自ICU、急診科等臨床科室；體外藥敏試驗表型為CRE 80株(包括肺炎克雷伯菌60株、陰溝腸桿菌7株、大腸埃希菌13株)，對碳青霉烯酶類抗生素敏感的菌株21株(包括肺炎克雷伯菌13株、陰溝腸桿菌2株、大腸埃希菌5株、產氣腸桿菌1株)。菌株分布結果見表2。

表2 臨床分離CRE菌株分布

2.2 CRE碳青霉烯類耐藥基因檢測結果 80株CRE菌株中碳青霉烯酶基因陽性為79株，碳青霉烯酶基因陰性為1株，其中檢測到KPC基因型61株(76.25%)，NDM基因型10株(12.50%)，IMP基因型6株(7.50%)，VIM基因型2株(2.50%)；未檢測到OXA-48基因型，21株對碳青霉烯類抗生素敏感的細菌均未檢測到耐藥基因。代表性CRE菌株基因型檢測結果見圖1。

2.3 膠體金免疫層析法檢測 經膠體金免疫層析法檢測，結果顯示，61株KPC基因型均為陽性，10株NDM基因型均為陽性，6株IMP基因型均為陽性，2株VIM基因型均為陽性，膠體金免疫層析法對CRE的篩選敏感性為100%，特異性為100%，四種酶型分別與PCR結果進行一致性檢驗分析，Kappa值均為1，完全一致。具體分析結果見表3。

3 討論

目前，臨床感染性疾病中革蘭陰性細菌感染率約占50%，碳青霉烯類抗菌藥物作為最后一道防線已被臨床廣泛應用。細菌耐藥監測數據顯示，革蘭陰性桿菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率逐年增加[5-6]。目前的研究[7-8]發現，腸桿菌科細菌主要通過產碳青霉烯酶發揮對碳青霉烯類抗菌藥物產生耐藥性，碳青霉烯酶依據Ambler分類主要分為三類，包括A類酶、B類酶和D類酶。A類酶在含有絲氨酸殘基的部位進行催化作用，又稱為絲氨酸酶，其中KPC基因是我國最常見的基因型；B類酶又稱金屬酶，可被 EDTA 等含有金屬離子螯合劑抑制，包括 IMP、VIM、NDM等基因，IMP 基因是目前報道的最早發現的金屬酶，其水解碳青霉烯類抗生素的能力較強；D類酶對亞胺培南具有較高水解活性，在腸桿菌科細菌中發現的唯一基因型是OXA-48，目前臨床分離的產D類酶菌株較少[9-10]。臨床試驗證明新型β-內酰胺類/β-內酰胺酶抑制劑復合物等抗生素對大多數產A類和D類酶CRE菌株有效，但對B類酶無效。因此，區分CRE產酶類型對合理選擇抗生素及臨床治療具有重要意義。

表3 PCR法與膠體金免疫層析法結果對比分析

本研究針對蚌埠醫學院第一附屬醫院2017年7月至2020年12月收集的CRE菌株，進行耐藥基因檢測，在80株CRE菌株中，79株檢測出耐碳青霉烯酶基因，其中表達KPC基因有61株，表達NDM基因有10株，表達IMP基因有6株，表達VIM基因有2株；未檢測到OXA-48基因型。本研究中檢測到的最主要基因型是KPC，由此可見本地區臨床分離的CRE菌株KPC仍是最主要的碳青霉烯酶基因型，與前期報道[11-12]基本一致。另外，我們還檢測到NDM、IMP及VIM基因型，本研究中的10株產NDM菌株對碳青霉烯類抗生素在內的其他藥物幾乎全部耐藥。我國海南、武漢等地均有從腸桿菌科細菌中檢出NDM的報道[11]。由于抗生素的不合理使用，目前CRE的耐藥機制多樣，除產碳青霉烯酶外，還包括外膜蛋白的缺失或合并產超廣譜β-內酰胺酶及藥物外排泵高度表達等[13]。本研究中1株碳青霉烯類抗生素耐藥菌株的PCR法及膠體金免疫層析法檢測結果均為陰性，可能原因是該菌株通過產生其他碳青霉烯酶(OXA-23、GIM、SPM及GES等)或存在其他耐藥機制，需要我們進一步分析研究。

目前，臨床實驗室檢測碳青霉烯酶的方法主要有紙片協同試驗、mCIM和eCIM聯合實驗、改良Hodge實驗、顯色培養和PCR法等。改良Hodge試驗及mCIM試驗是2017版美國臨床和試驗室標準化協會(CLSI)推薦的碳青霉烯酶表型篩選方法。而mCIM和eCIM聯合實驗室是目前臨床使用較多的碳青霉烯酶檢測方法。膠體金免疫層析法是最新研發的碳青霉烯酶快速檢測方法，該法將KPC、IMP、VIM、NDM和OXA-48型5種碳青霉烯酶的單克隆抗體與膠體金偶聯，并固定于醋酸纖維素膜上，用于培養后獲取的細菌樣本中KPC、IMP、VIM、NDM和OXA-48型5種碳青霉烯酶的體外定性檢測，可快速鑒定細菌樣本中是否存在5種碳青霉烯酶中一種或幾種，從而鑒定感染病人是否對碳青霉烯類抗生素具有耐藥性[14]。目前該方法在中國尚未作為臨床常規檢測CRE碳青霉烯酶，其檢測效能尚需進一步評價，本研究采用膠體金免疫層析法對79株CRE菌株進行產酶檢測，并與PCR檢測結果進行一致性分析，結果證實膠體金免疫層析法對KPC、IMP、VIM、NDM的檢測敏感性高(100%)、特異性強(100%)，更重要的是操作簡單快速，僅需20 min左右即可鑒定出CRE產碳青霉烯酶類型。

總之，膠體金免疫層析法是一種操作簡便、快速高效的CRE碳青霉烯酶檢測方法，該法檢測產碳青霉烯酶腸桿菌耐藥表型的敏感性和特異性較高，對流行病學調查、感染控制及臨床抗菌藥物管理優化均具有重要的意義。