基于內(nèi)皮細胞/周細胞構(gòu)建大鼠視網(wǎng)膜血管新生體外三維模型

劉光輝,楊田野,洪雅軍,王 航,潘銘東,孟 春,徐朝陽

0引言

視網(wǎng)膜新生血管性疾病是臨床常見的眼病，如糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity,ROP)、年齡相關(guān)性黃斑病變(age-related macular degeneration,ARMD)等，其病理過程中均涉及由視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(endothelial cells，ECs)和視網(wǎng)膜微血管周細胞(retinal microvascular pericytes，RMPs)共同參與的血管新生(angiogenesis)。構(gòu)建體外血管新生模型是探索血管新生的生理病理過程、研究新生血管性疾病重要的工具。截至目前，已有不少學(xué)者建立了體外三維血管模型[1-2]，但是大都僅以單一的血管ECs為基礎(chǔ)，未能充分模擬ECs和RMPs相互配合的血管新生過程。本研究擬采用ECs和RMPs在內(nèi)的全微血管成分細胞構(gòu)建大鼠視網(wǎng)膜血管體外三維培養(yǎng)模型，以便為視網(wǎng)膜新生血管性疾病的機制研究提供一個有力的工具。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物3周齡健康清潔級雄性初斷乳SD大鼠20只，體質(zhì)量40±5g，購買自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[許可證號SCXK(滬)2007-0005]。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為21℃～25℃，相對濕度為50%～55%。普通顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，12h/12h明暗交替光照。實驗動物的使用遵循國家科學(xué)技術(shù)委員會1988年頒布的《實驗動物管理條例》，并經(jīng)過福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑及儀器內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM，美國Scien Cell公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素-鏈霉素雙抗(10kU/mL青霉素+10mg/mL鏈霉素，美國HyClone公司)；細胞示蹤劑(美國Molecular Probes公司)；Ⅰ型膠原酶(美國Sigma公司)；人工基質(zhì)膠Matrigel(美國BD公司)；血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGF-A)抗體(武漢愛博泰克生物)；24孔板及培養(yǎng)皿(美國Corning公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱(美國NUARE公司)。

1.2方法

1.2.1ECs分離培養(yǎng)按參考文獻[3]描述方法分離、純化、培養(yǎng)、鑒定大鼠視網(wǎng)膜微血管ECs。大鼠經(jīng)乙醚麻醉后用頸椎脫臼法處死，摘取眼球轉(zhuǎn)移至75%乙醇中浸泡1min，用預(yù)冷的PBS(含有1%青霉素-鏈霉素雙抗)洗3遍。分離剝出視網(wǎng)膜，剪成1mm3大小的組織塊。先用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化10min，然后再用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2% Ⅰ型膠原酶消化20min。用ECM培養(yǎng)基重懸組織接種于培養(yǎng)瓶中，接種在明膠包被的培養(yǎng)瓶中，每3d換液1次。選用第3～7代經(jīng)鑒定驗證的ECs開展后續(xù)實驗。

1.2.2RMPs分離培養(yǎng)按照我們之前研發(fā)的方法分離、純化、培養(yǎng)、鑒定大鼠RMPs[4]。如前述，將1mm3大小的視網(wǎng)膜組織塊先用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化10min，然后再用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2% Ⅰ型膠原酶消化15min。用含有體積分?jǐn)?shù)20% FBS的DMEM-L培養(yǎng)基重懸組織接種于培養(yǎng)瓶中，每3d換液1次。選用第3～7代經(jīng)鑒定后的RMPs開展后續(xù)實驗。

1.2.3三維共培養(yǎng)將Matrigel、移液管和24孔培養(yǎng)板放置4℃冰箱，預(yù)冷過夜。按照說明書稀釋細胞示蹤劑，分別用紅色和綠色細胞示蹤劑孵育ECs和RMPs 24h。將Matrigel用ECM培養(yǎng)基按照1∶1進行稀釋，24孔板每個孔加入400μL稀釋后的Matrigel膠，置入細胞培養(yǎng)箱孵育30min以上，待Matrigel膠凝固后備用。將標(biāo)記后的細胞用PBS洗滌3次，消化成細胞懸液，將細胞濃度調(diào)至2×105cell/mL。將ECs和RMPs按9∶1進行混合，每孔加入400μL細胞懸液，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。倒置顯微鏡下動態(tài)觀察。

1.2.4酶聯(lián)免疫法檢測在ECs/RMPs共培養(yǎng)體系培養(yǎng)12、24、48h后，收集細胞培養(yǎng)的上清，按照酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書操作，檢測上清液中VEGF-A的表達水平。

統(tǒng)計學(xué)分析：采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)處理，采用單因素重復(fù)測量方差分析進行檢驗，兩兩比較采用Bonferroni法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1ECs/RMPs三維培養(yǎng)生長情況混合接種培養(yǎng)12h時，可以觀察到RMPs能被ECs招募，聚集成為大小不等的細胞團塊，并有部分ECs增殖與RMPs共同形成簡單的條索樣結(jié)構(gòu)。24h時，ECs/RMPs共同形成具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的血管樣條索網(wǎng)。觀察時，條索網(wǎng)各部分處于不同的焦平面，提示為三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。之后，血管樣條索網(wǎng)逐漸出現(xiàn)崩解。48h時，網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)出現(xiàn)明顯崩解，僅保持少量不完整的簡單的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。至72h時，血管樣條索網(wǎng)完全崩解，僅殘留少量小的離散的細胞團，見圖1。

圖1 ECs/RMPs三維共培養(yǎng) A：ECs/RMPs以9∶1比例接種于三維共培養(yǎng)系統(tǒng)，ECs以紅色細胞示蹤劑標(biāo)記，RMPs以綠色細胞示蹤劑標(biāo)記；B、C：12h時，ECs(黃色箭頭)能招募RMPs(白色箭頭)成為細胞團，并有部分形成簡單的條索樣結(jié)構(gòu)；D：24h時，ECs/RMPs能形成廣泛復(fù)雜的具有腔隙的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，三維結(jié)構(gòu)以ECs(黃色箭頭)為主，RMPs(白色箭頭)鑲嵌其中；E：48h時，三維結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯崩解，僅保持少量不完整的簡單網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；F：72h時，三維結(jié)構(gòu)完全崩解，僅殘留少量小的離散的細胞團。

2.2三維培養(yǎng)時VEGF-A的表達水平在血管網(wǎng)逐漸發(fā)育完善過程中，VEGF-A表達量上升。血管網(wǎng)出現(xiàn)崩解時，VEGF-A表達量下降。檢查顯示，培養(yǎng)12、24、48h時的上清液中VEGF-A表達量分別為1.757±0.249、3.216±0.510、0.700±0.257μg/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=82.802，P<0.01)。培養(yǎng)24h時的上清液中VEGF-A表達量較12h表達量顯著增高，48h時的上清液中VEGF-A表達量較12、24h表達量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 三維培養(yǎng)不同時間點上清液中VEGF-A的表達水平 aP<0.05 vs 48h；cP<0.05 vs 12h。

3討論

血管新生指在原有小靜脈或其他毛細血管的基礎(chǔ)上，ECs以芽生或非芽生的形式并在周細胞的配合下生成新生血管的過程，其一般包括基質(zhì)降解、ECs移行、ECs增殖、ECs管道化分支形成血管環(huán)和新的基底膜形成等步驟[5-6]。血管新生是血管從少到多的生物學(xué)過程，常見于人體各種組織器官的生理或病理活動中，如視網(wǎng)膜、角膜等。

視網(wǎng)膜是人體微血管密度最高的組織之一，常因缺血、缺氧或其他因素誘發(fā)血管新生，導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管性疾病，如DR、ROP、ARMD等。視網(wǎng)膜新生血管性疾病是眼科臨床的致盲性疾病，相關(guān)研究是目前眼科研究的熱點方向之一。在體內(nèi)研究中，動物模型存在直接觀察不便等不利因素，研究觀察難度大。而體外三維培養(yǎng)既能夠模擬ECs出芽、移行、增殖、分化等體內(nèi)血管生成具體過程[7]，又具有易于觀察的優(yōu)勢，更具有研究價值。因此，構(gòu)建簡便、可靠、穩(wěn)定的血管新生體外三維培養(yǎng)模型對于開展視網(wǎng)膜新生血管性疾病的基礎(chǔ)研究工作具有重要的意義。

體外血管新生三維模型構(gòu)建起始于1980年代。在1980年，F(xiàn)olkman等[8]首次觀察到ECs在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中能夠形成血管樣條索的趨勢。Martins等[9]證實三維培養(yǎng)中的ECs生長與體內(nèi)血管生成更為類似。其在硬度適中的膠原類基質(zhì)中可以分化形成靜態(tài)管狀[10]。鼠尾膠、血漿凝塊、纖維蛋白、水凝膠、Matrigel等均可以用于ECs三維培養(yǎng)的基質(zhì)[11-12]。其中Matrigel是一種從EHS小鼠腫瘤中提取的細胞外基質(zhì)混合物，含有層黏連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、肝素糖蛋白、生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等多種成分[13]。其在低溫狀態(tài)下呈液態(tài)；在37℃條件下，能聚合形成具有生物學(xué)活性的三維基質(zhì)，模擬體內(nèi)細胞基底膜的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能。由于Matrigel成分與哺乳動物細胞基底膜成分類似，故常為體外三維培養(yǎng)研究所選用。

在種子細胞來源方面，學(xué)者們已經(jīng)開發(fā)了多種來源的ECs用于血管新生體外三維模型的培養(yǎng)，如源自人、嚙齒類動物、牛、犬等；所取ECs的血管如臍靜脈、頸靜脈、主動脈等處大血管及真皮等處微血管[2]。其中，人臍靜脈ECs因為來源廣泛、分離簡單而被廣泛應(yīng)用。此外，內(nèi)皮祖細胞見諸于培養(yǎng)報道[14]。然而需知，不同組織血管來源的ECs的生物學(xué)行為存在差異，在血管生成的潛能、血管張力和免疫耐受等方面表現(xiàn)不同[15]，需要合理、審慎地選擇培養(yǎng)種子細胞以適用不同研究目的需要。同時，血管新生所形成的成熟新生血管除了ECs這一主體細胞之外，還有一種重要的細胞成分——周細胞。周細胞是正常微血管管壁的構(gòu)成細胞，在體內(nèi)血管新生時具有血管基質(zhì)降解、控制ECs增殖、調(diào)控新生血管生長的功能[16]。在血管新生體外三維培養(yǎng)模型構(gòu)建時，我們需要考慮周細胞對血管新生復(fù)雜而多樣的作用，合理、完善的血管新生體外三維培養(yǎng)模型應(yīng)該包含以上兩種細胞，而這正是既往研究所欠缺的——其往往僅采用單一的ECs作為種子細胞。在本次研究中，我們首次基于實驗室最常用實驗動物大鼠的視網(wǎng)膜微血管ECs作為主要種子細胞進行培養(yǎng)，以適用視網(wǎng)膜新生血管性疾病模型的需要。并加入了適量的RMPs進行聯(lián)合培養(yǎng)，種子細胞較既往研究更為全面。本次研究結(jié)果顯示ECs在培養(yǎng)的過程中能招募RMPs，彼此共同形成血管樣條索結(jié)構(gòu)。這一現(xiàn)象與體內(nèi)血管新生時ECs招募RMPs形成新生血管的生物學(xué)行為類似[5-6]，提示這種三維培養(yǎng)方式或?qū)⒛芨浞值啬M體內(nèi)視網(wǎng)膜血管新生的真實生理或病理過程。

在培養(yǎng)方法方面，學(xué)者們既往提出了多種不同的方案，如動脈環(huán)培養(yǎng)法、表面培養(yǎng)法、夾心培養(yǎng)法、混和培養(yǎng)法、微載體培養(yǎng)法等，各種方法具有各自的優(yōu)缺點[1]，需要根據(jù)研究目的選擇適用的方法。其中表面培養(yǎng)法指將種子細胞添加在凝固的基質(zhì)凝膠表面進行培養(yǎng)的方法，能夠較好模擬體內(nèi)微血管成分細胞降解基質(zhì)、相互招募形成新生血管的過程，具有形成管狀、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)快的特點。本次研究選用表面培養(yǎng)法進行了培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)孵育后12h即可以形成簡單的血管樣條索，與既往單純采用ECs作為種子細胞的約48h才能檢測到管腔樣結(jié)構(gòu)的研究[17]要快，能夠滿足快速實驗的需要。

如何判定模型的有效性是血管新生體外三維培養(yǎng)模型一個關(guān)鍵的所在。從生理學(xué)角度而言，理想的血管新生體外三維模型應(yīng)能詮釋體內(nèi)有代表性的血管新生過程：原有微血管充血，ECs、周細胞激活；基底膜降解；ECs移行，穿過基底膜，向刺激原運動；ECs和周細胞遷移、分裂、增生；形成新的毛細血管腔，由周細胞圍繞；新的基底膜形成，層黏連蛋白發(fā)育；毛細血管袢及網(wǎng)形成[5-6]。Folkman在體外首次觀察到血管新生時，發(fā)現(xiàn)ECs形成的毛細血管樣結(jié)構(gòu)中存在腔隙[8]，這種現(xiàn)象能被光鏡所觀察。后續(xù)血管新生體外三維培養(yǎng)研究報道參考了該報道，均以毛細血管樣結(jié)構(gòu)中是否存在腔隙來判定培養(yǎng)模型的有效性。在本次研究中，我們觀察到12h時，ECs能招募RMPs成為細胞團，并形成簡單的條索樣結(jié)構(gòu)。之后進程明顯加速，在24h時能形成廣泛復(fù)雜的具有腔隙的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。三維結(jié)構(gòu)以ECs為主，RMPs鑲嵌其中，這種細胞構(gòu)架與體內(nèi)視網(wǎng)膜微血管結(jié)構(gòu)類似。這表明本研究基于全微血管細胞成分(ECs和RMPs)所構(gòu)建的血管新生體外三維培養(yǎng)模型具有充分的有效性。

同時，我們也觀察到本次研究中三維網(wǎng)狀血管樣條索持續(xù)的時間較短，在孵育的第24h達到頂峰狀態(tài)，之后開始出現(xiàn)崩解，48h時只保持少量不完整的簡單的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，72h后僅殘留少量小的離散的細胞團。這一現(xiàn)象除與培養(yǎng)基內(nèi)供細胞生存、增殖使用的營養(yǎng)物質(zhì)有限相關(guān)外，還可能與VEGF等促血管生成的細胞因子含量下降相關(guān)[18]。VEGF是一種分泌型蛋白，可由ECs分泌，是血管新生過程中重要的細胞因子[19]。本研究觀察到，隨著ECs/RMPs三維血管樣條索網(wǎng)的發(fā)生，VEGF-A的表達量升高。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)退化時，VEGF-A的表達量下降。這一結(jié)果表明VEGF-A在三維培養(yǎng)模型構(gòu)建中參與了血管樣條索網(wǎng)的生成過程。但是血管新生是受多重因素共同影響的復(fù)雜過程，如何維持三維血管樣條索網(wǎng)的存在時間有待進一步研究。

本研究成功基于微血管全成分細胞ECs和RMPs構(gòu)建了大鼠視網(wǎng)膜血管新生體外三維培養(yǎng)模型，可以作為視網(wǎng)膜新生血管相關(guān)性疾病體外研究的工具。