多西環素對人翼狀胬肉成纖維細胞血管生成擬態形成的影響

賀夢璇，張俊芳，楊 鈴，秦 柏，顧宏衛，管懷進，石海紅

0引言

翼狀胬肉是最常見的眼表疾病之一，臨床表現為新生組織不斷生長、增厚，呈三角形逐漸侵入角膜，不僅影響美觀，還可導致干眼、角膜散光[1]，如覆蓋瞳孔區則嚴重影響患者視力。翼狀胬肉具有許多腫瘤樣特性，如輕度發育不良、局部浸潤、高復發率、雜合性丟失、微衛星不穩定性及P53基因突變等[2]，故可認為其是一種腫瘤樣病變。血管生成擬態(vasculogenic mimicry，VM)是腫瘤缺乏血液和氧氣供應時，腫瘤細胞通過自身變形及細胞外基質重塑進而形成的類似血管樣的通道，是一種不依賴血管內皮細胞的微循環形式[3]。這一結構在眼脈絡膜惡性黑色素瘤中首次被發現[4]，是一種新的血液供應模式。研究發現，VM也存在于翼狀胬肉組織中，參與胬肉的營養供應[5]。多西環素(doxycycline，DOX)作為基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)的廣譜抑制劑，具有抑制細胞外基質降解及重塑的能力。本研究利用人翼狀胬肉成纖維細胞(human pterygium fibroblasts，HPFs)構建翼狀胬肉體外VM模型，探討DOX對翼狀胬肉VM形成的影響及其可能的分子機制，為翼狀胬肉的防治提供理論依據。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1樣本采集收集2019-09于南通大學附屬醫院眼科行翼狀胬肉切除術的患者8例，其中男4例，女4例，年齡63.00±2.07歲，均為翼狀胬肉初發性進展期，排除其他眼表疾病和全身疾病。收集手術切除的新鮮翼狀胬肉頭部上皮下組織。本研究通過南通大學附屬醫院倫理委員會審查批準，患者均簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑與儀器主要試劑：胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶-EDTA、DMEM/F12培養基、DMSO(美國，Gibco公司)，強力霉素(美國，Selleck公司)，CCK-8試劑盒(日本，Dojindo公司)，Matrigel膠(美國，BectonDickinson公司)，過碘酸-雪夫(periodic acid schiff，PAS)染色試劑盒(中國，索萊寶公司)，鼠抗人波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體、鼠抗人角蛋白(CK)單克隆抗體、鼠抗人血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多克隆抗體(英國，Abcam公司)，兔抗人MMP-9多克隆抗體(美國，GeneTex公司)，抗鼠/兔通用型免疫組織化學檢測試劑盒(中國，基因科技股份有限公司)，細胞蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、抗體稀釋液及增強化學發光反應檢測試劑盒(中國，索萊寶公司)。主要儀器：紫外分光光度計(NanoDrop 2000c；美國，Thermo公司)，DM3000光學顯微鏡及顯微攝像系統(德國，Leica公司)，高速冷凍離心機(德國，Eppendorf公司)。

1.2方法

1.2.1HPFs原代培養、鑒定及實驗分組將手術切除的新鮮翼狀胬肉頭部上皮下組織用含1%青霉素-鏈霉素的PBS緩沖液漂洗3次，剪碎，加入0.08%胰蛋白酶-EDTA，室溫消化8min，完全培養基終止消化，1500r/min離心5min棄上清，將組織小塊均勻接種于培養瓶內，將培養瓶底朝上置于37℃、5%CO2培養箱中，24h后待組織小塊貼壁，加入適量完全培養基，緩慢翻轉培養瓶，靜置培養，每3d換液一次。采用鼠抗人Vimentin單克隆抗體、鼠抗人CK單克隆抗體免疫細胞化學染色進行細胞鑒定，具體實驗步驟根據試劑說明書操作。本研究取2～5代細胞用于實驗，分為對照組(正常培養)、DOX終濃度分別為50、100、200mg/L的低、中、高實驗組進行下游實驗。

1.2.2CCK-8法檢測細胞活力將處于對數生長階段的HPFs消化后以0.6×104個/孔的數量均勻接種在96孔板內，每孔終體積100μL，每組設置6個復孔，24h后進行細胞分組處理，同時設置只加培養基的空白對照組。分組處理48h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，置細胞培養箱避光孵育2h后，用酶標儀于450nm處測定每個孔的吸光度(OD值)，計算平均值。

1.2.3劃痕實驗檢測細胞遷移能力將處于對數生長階段的HPFs消化后以1×105個/孔接種于6孔板中，待細胞融合度接近100%時，用200μL無菌槍頭在每個孔垂直、力道均勻地劃過2～3道豎線，PBS洗去懸浮細胞，然后換用無血清培養基分組培養，并于劃痕后0、48h通過顯微鏡拍照觀察，計算細胞在各個時間點向劃痕處移動的相對距離。

1.2.4細胞三維培養及PAS染色將預先4℃過夜融化的Matrigel膠以每孔50μL加至96孔板，十字晃動，使之均勻分布避免產生氣泡。為防止Matrigel膠不均勻凝固，所有操作必須在冰上進行。將包被好的96孔板置于37℃孵箱內30min使其固化。細胞分組處理48h后消化重懸，以0.8×104個/孔種于Matrigel膠上，置細胞培養箱內培養5h后，倒置顯微鏡下觀察細胞的管狀結構排列及成管的完整程度，隨機選取5個不同視野計數成管的數量，取每個視野均值。觀察完成后，將上述培養5h后的細胞行PAS染色。染色步驟為0.5%高碘酸氧化5min，蒸餾水稍洗，Schiff氏液避光染色10min，0.5%偏重亞硫酸鈉分化2～5s，水洗2次，陽性表現為紫紅色。

1.2.5Westernblot檢測MMP-9和VEGF的表達收集分組處理48h后的細胞，利用細胞蛋白抽提試劑盒提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制備10% SDS-PAGE凝膠，每孔加入20μg蛋白樣品，常規電泳、轉膜、封閉，隨后分別加入兔抗人MMP-9抗體(1∶500)、鼠抗人VEGF抗體(1∶3000)、鼠抗人GAPDH抗體(1∶5000)4℃孵育，12h后，TBST漂洗，加入相應二抗(1∶5000)室溫孵育1h，化學發光法顯影，成像系統拍照，Image J軟件分析各組灰度值。

2結果

2.1HPFs原代培養及鑒定翼狀胬肉組織塊接種后約10d可見成纖維細胞從組織塊邊緣爬出，細胞形態多為長梭形、三角形，逐漸向四周延伸，其間夾雜部分類圓形上皮細胞(圖1A)。當細胞傳至第2代已基本純化，呈長梭形，細胞長滿后呈旋渦狀(圖1B)。免疫細胞化學染色結果顯示CK表達陰性(圖1C)，Vimentin表達陽性，細胞質內呈棕黃色染色(圖1D)，符合成纖維細胞特性。

圖1 HPFs原代培養及鑒定 A：翼狀胬肉組織塊邊緣成纖維細胞(箭頭示)向四周生長；B：經傳代純化后的HPFs呈旋渦狀生長；C：CK表達陰性；D：Vimentin表達陽性，細胞質呈棕黃色。

2.2DOX對HPFs活力的影響CCK-8實驗結果顯示，對照組、DOX低、中、高濃度組HPFs的OD值分別為1.14±0.09、0.91±0.09、0.71±0.05、0.23±0.02，差異有統計學意義(F=447.888，P<0.05)，且DOX處理組之間兩兩相比，差異亦均有統計學意義(P<0.05)，表明DOX抑制HPFs活力呈劑量依賴性。

2.3DOX對HPFs遷移能力的影響細胞劃痕實驗結果顯示，對照組、DOX低、中、高濃度組HPFs的遷移距離分別為0.21±0.01、0.15±0.00、0.04±0.01、-0.01±0.00mm，各濃度DOX組細胞遷移距離均明顯低于對照組，差異具有統計學意義(F=778.511，P<0.05)。三組DOX組組間相比，遷移距離差異亦具有統計學意義(均P<0.05)。200mg/L DOX組因藥物濃度較高，細胞質減少，細胞變小，故劃痕間距增加。結果表明，DOX具有抑制HPFs細胞遷移的作用，且呈劑量依賴性，見圖2。

圖2 DOX對HPFs遷移能力的影響。

2.4DOX對HPFs血管生成擬態的影響細胞三維培養結果顯示，HPFs能夠黏附于Matrigel膠表面，通過細胞自身變性、彼此相連形成大小不等的網格樣、環狀管腔結構。對照組PAS染色呈陽性，提示管腔樣結構是由HPFs構成，即VM。可見對照組及DOX低濃度組形成的管腔均完整(圖3A、3B)，當DOX濃度大于50mg/L時，開始出現不完整的管腔形態，部分細胞形成樹枝樣結構(圖3C、3D)。對照組、DOX低、中、高濃度組形成的VM密度分別為每10倍視野37.33±2.08、28.33±1.53、12.00±1.00、1.67±0.58個，差異有統計學意義(F=384.889，P<0.05，圖3E)，且DOX處理組之間兩兩相比，差異亦均有統計學意義(P<0.05)。結果表明，隨著DOX濃度的增加，VM逐漸變小，數量逐漸減少，直至不能形成完整的管腔結構。

圖3 DOX對HPFs血管生成擬態的影響 A：對照組，形成網格樣、環狀管腔結構，PAS染色呈陽性；B：DOX低濃度組，管腔結構完整，周徑變小，數量減少；C：DOX中濃度組，部分細胞形成樹枝樣結構，不能形成完整的管腔，管腔數較少；D：DOX高濃度組，無明顯管腔結構形成；E：各組細胞VM密度的比較，aP<0.05 vs 對照組；cP<0.05 vs 50mg/L DOX組；eP<0.05 vs 100mg/L DOX組。

2.5DOX對HPFs中MMP-9和VEGF表達的影響Western blot檢測結果顯示，對照組、DOX低、中、高濃度組細胞MMP-9和VEGF蛋白相對表達量差異均具有統計學意義(F=94.239，P<0.05；F=396.281，P<0.05)。結果表明，隨著DOX濃度增高，MMP-9及VEGF蛋白表達下調，見圖4。

圖4 DOX對HPFs中MMP-9及VEGF表達的影響 A：Western blot檢測結果；B：MMP-9相對表達量化分析結果；C：VEGF相對表達量化分析結果。aP<0.05 vs 對照組；cP<0.05 vs 50mg/L DOX組；eP<0.05 vs 100mg/L DOX組。

2.6HPFs血管生成擬態與MMP-9和VEGF表達的相關性雙變量相關性分析顯示，HPFs形成的VM密度與MMP-9和VEGF蛋白的表達水平呈顯著正相關(r=0.949、0.960，均P<0.05)。

3討論

翼狀胬肉是眼科的常見病和多發病，據最新統計，我國40歲及以上人群翼狀胬肉患病率為13.4%[6]，處于較高水平，且隨著年齡的增長而不斷升高，多見于戶外勞動者，以漁民、農民發病最多，可能與粉塵、日光、煙霧等長期慢性刺激有關[7]，但具體病因和發病機制尚未完全清楚[8]。李永平等[5]利用CD34/PAS雙染首次在翼狀胬肉組織中發現VM結構，主要表現為PAS陽性的細胞外基質包繞在成纖維細胞伸出的突起表面形成管道狀結構。隨后陳俊杰等[9]證明VM在進展期翼狀胬肉中的陽性率明顯高于靜止期。目前，關于翼狀胬肉VM調控的相關機制尚未見報道。

VM是近年發現的存在于腫瘤中的一種新的微循環形式，其與常規的血管結構不同，主要特點包括VM管道由腫瘤細胞及細胞外基質構成；管道內壁沒有血管內皮細胞；血液可在無內皮管道中流動；VM周圍沒有明顯的炎癥細胞浸潤及壞死[10]。研究表明，VM表達陽性的腫瘤存在更強的侵襲、轉移和耐藥能力且預后更差[11]。腫瘤VM調控的機制較為復雜，有研究表明，MMPs幾乎能降解腫瘤細胞外基質的各種蛋白成分，是腫瘤侵襲周圍組織并向遠處轉移過程中最為關鍵的因子，與VM現象呈顯著正相關[12-13]。Xu等[14]在脈絡膜黑色素瘤組織中發現，VM陽性組織VEGF表達明顯高于VM陰性組織，且VEGF可以提高人類脈絡膜黑色素瘤細胞遷移、侵襲及VM形成能力，VM與VEGF表達亦呈顯著正相關。與腫瘤組織相同，翼狀胬肉組織中MMP-9和VEGF的表達也明顯增加[15-16]。MMP-9可以降解胬肉細胞外基質Ⅳ型、Ⅴ型膠原、彈性蛋白及明膠，導致前彈力層溶解，使胬肉向角膜及深層浸潤[17]。VEGF主要通過增加血管通透性、促進細胞外基質變性、提高血管內皮細胞遷移及增殖能力等促進翼狀胬肉血管形成[18]。MMP-9和VEGF的高表達為翼狀胬肉形成VM提供了一定的分子基礎。

DOX不僅是一種長效的四環素類抗生素，而且還是MMPs的廣譜抑制劑，具有抗菌、抗炎、抑制細胞增殖、免疫調節、抑制蛋白水解、減少血管生成等作用[19]，可有效抑制腫瘤的生長和轉移、保護因腦梗而缺血的神經[20]，參與類風濕關節炎[21]、牙周病[22]等多種疾病的治療。Meng等[23]研究發現，腹腔注射DOX(0.1mL/d)的肝癌裸鼠，腫瘤血管數及VM管腔數均較少，腫瘤生長緩慢，裸鼠存活時間延長；在體外培養的肝癌細胞VM模型中，DOX可明顯減少VM的形成，降低MMPs的表達，推測DOX對肝癌VM的抑制作用可能與其降低MMPs的表達有關。Rúa等[24]在一項隨機雙盲安慰劑對照的臨床試驗中發現口服DOX(200mg/d)可降低部分患者翼狀胬肉體積，而具體的作用機制尚未行進一步研究。

本研究發現DOX能顯著抑制HPFs的活力及遷移能力，降低HPFs的MMP-9及VEGF表達，在運用Matrigel膠構建的三維培養HPFs模型中觀察到HPFs能在體外形成VM，這與李永平等[5]研究發現的翼狀胬肉VM結構是由成纖維細胞構成的結論一致。MMP-9及VEGF作為細胞遷移和侵襲的重要元素，本研究結果提示DOX可能通過下調MMP-9及VEGF的表達減慢HPFs分解細胞外基質的速度，抑制細胞遷移的能力，進而減少HPFs構建的VM數量。當DOX濃度增加時，MMP-9和VEGF表達降低，VM的形成明顯受到抑制。相關性分析顯示，MMP-9和VEGF的表達與VM密度呈顯著正相關。大量研究表明，進展期翼狀胬肉組織中MMP-9和VEGF的表達明顯高于靜止期，復發型翼狀胬肉中這兩個分子的表達又明顯高于初發型，即MMP-9和VEGF的高表達與翼狀胬肉的發生發展密切相關[25-28]。故我們推測VM也與翼狀胬肉的進展密切相關，VM陽性的翼狀胬肉組織具有更強的促進胬肉基質蛋白降解、溶解角膜前彈力層及新生血管的能力，極大地促進翼狀胬肉的進展。這與VM陽性的腫瘤組織存在更強的侵襲及轉移能力一致。

綜上所述，DOX可通過減少MMP-9及VEGF的表達抑制HPFs的活力及遷移能力，減少VM的形成，提示MMP-9和VEGF可能參與翼狀胬肉表達VM的分子機制。但本研究仍存在不足，此次研究我們利用DOX作為降低MMP-9及VEGF表達的干預措施，僅在體外細胞水平上進行實驗，鑒于體內外研究可能具有差異，將進一步進行活體實驗并進行毒理學方面的研究，為尋找新方法防治翼狀胬肉提供可靠依據。