高齡孕婦蛻膜中ER/PR水平及其與妊娠結局的相關分析

郭葉青，劉 娟，李 陽，湯 寧，姚 穗

（1.湖南師范大學第一附屬醫院產科，長沙 410005；2.株洲中心醫院婦產科，株洲 412000；3.瀏陽市人民醫院婦產科，瀏陽 410300）

全面兩孩政策實施后，高齡妊娠（35周歲以上）發生率顯著上升，其妊娠并發癥發生率也明顯增加，包括流產、死產、早產、低出生體重、胎盤植入和子癇前期等［1，2］。有研究發現將高齡母親的受精卵移植到“年輕”的子宮內進行發育，其后代心臟室中隔缺損的風險會大大降低［3］。還有學者［4］發現將高齡雌鼠胚胎置于年輕雌鼠子宮內代育能改善絕大部分胚胎和胎盤的發育異常。因此，高齡所致不良妊娠可能還與子宮密切相關。子宮蛻膜化是成功妊娠的關鍵因素之一，而雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）蛋白共同調控子宮蛻膜化［5］。為此，本研究檢測了高齡孕婦蛻膜中ER、PR水平，并研究了其與妊娠結局的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料與分組對2018年1月～8月間于湖南師范大學附屬第一醫院產科住院分娩的孕婦，收集其一般資料和妊娠結局。納入標準：自然受孕的單胎妊娠，孕周≥28周，且分娩時成功收集蛻膜組織。排除標準：胎兒染色體異常或胎兒畸形，子宮畸形，孕期有激素或免疫抑制劑治療史，早產史，糖尿病或高血壓家族史，宮腔操作≥3次，合并嚴重的內外科疾病。本研究方案倫理會委員會已批準，研究對象知情、自愿，并簽定知情同意書。最終有141例納入本研究，以年齡≥35周歲定義為高齡，根據年齡分為年輕組和高齡組，再結合妊娠結局分為高齡正常結局組、高齡不良結局組、年輕正常結局組和年輕不良結局組。

1.2 方法

1.2.1 診斷標準子癇前期、妊娠期糖尿病（GDM）、羊水過少、早產、胎兒生長受限（FGR）、新生兒窒息的診斷標準均參照人民衛生出版社謝幸等［6］編著的《婦產科學》（第9版）。分娩孕周依據末次月經和孕早期B超聯合確定。

1.2.2 觀察指標對高齡組和年輕組孕婦的一般資料（包括年齡、分娩孕周、孕產史、孕前BMI指數、新生兒出生體重、分娩方式等）和不良妊娠結局發生率分別比較。分析ER、PR表達情況與妊娠結局的關系。

1.2.3 蛻膜組織中ER、PR的檢測胎盤娩出后30min內，在無菌操作下，于胎盤母體面中央切取大約為1.0cm×1.0cm×1.0cm大小的蛻膜組織（注意避開鈣化、出血和壞死區）；用生理鹽水洗凈血漬及細碎組織，置于10%中性緩沖福爾馬林液固定，脫水浸蠟和石蠟包埋，切片，采用SP免疫組織化學方法，由專人操作，實驗步驟嚴格按照操作方法說明實施，實驗設置HE染色對照、空白對照和陽性對照。

1.2.4 實驗試劑兔抗人雌孕激素受體單克隆抗體均購自福州邁新生物技術公司；二抗試劑盒 Kit-0014購自福州邁新生物技術公司。SP免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.5 結果判定由同一位病理科醫師觀察切片。ER和PR陽性染色均主要定位于細胞核，ER與PR陽性細胞的判斷：細胞核內出現淺黃色-桔黃色-棕黃色染色顆粒分布。依照Fromowitz綜合計分法［7］。根據染色的強度分級：細胞核內沒有染色或呈均勻一致的淡黃色，與背景一致的為0分；細胞核內可見少量的淡黃色顆粒，高于背景的為1分；細胞核內可見較多的深棕色顆粒為2分；細胞核內可見大量深棕色或褐色顆粒為3分。陽性細胞所占的百分率：無陽性細胞為0分；百分率≤25%為1分；百分率26%～50%為2分；百分率51%-75%為3分；百分率＞75%為4分。取以上兩項之和：和為0-1分為（-）；和為2-3分為（+）；和為4-5分為（++）；和＞5分為（+++）。

1.3 統計學分析運用SPSS 21.0軟件進行分析。計量資料以mean±SD表示，比較兩組樣本總體間差異采用獨立樣本t檢驗（方差齊）或Wilcoxon秩和檢驗（方差不齊），計數資料的比較采用χ2檢驗或 Fisher 確切概率法，ER與PR相關性采用Spearman相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料分析收集的孕婦共141例，其中年輕組88例，高齡組53例，年輕組與高齡組的年齡、分娩孕周、新生兒出生體重和不良妊娠結局發生率比較均有統計學差異（P＜0.05），兩組孕婦孕次、產次、孕前BMI、剖宮產率、新生兒1分鐘和5分鐘Apgar評分分別比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），結果見表1。

表1 一般臨床資料比較

2.2 不同年齡及妊娠結局組間ER、PR的比較單純按照年齡或妊娠結局分組，高齡組ER、PR表達水平較年輕組均顯著下降（P＜0.05）；不良結局組ER、PR表達水平較正常結局組均顯著下降（P＜0.05）。結合年齡和妊娠結局分組，同一妊娠結局下高齡組ER、PR表達水平較年輕組下降（P＜0.05）；同一年齡段內，不良結局組ER、PR表達水平較正常結局組下降，但無統計學差異（P＞0.05）。結果見表2。

表2 不同年齡及妊娠結局組間ER、PR的比較

2.3 蛻膜中ER與PR表達水平的相關性分析蛻膜中ER與PR的表達水平呈弱正相關關系，有統計學意義（r=0.301，P＜0.05）（見表3）。

表3 ER與PR表達水平的相關分析

3 討論

近年來，亞洲地區女性初產年齡上升2歲左右，高齡孕婦比例上升至19.1%［8］，高齡孕婦妊娠并發癥及死亡率均有升高［9］。本研究也提示高齡組孕婦早產、子癇前期、GDM、前置胎盤、FGR等的發生率較年輕組顯著升高。高齡妊娠患者不良妊娠結局的發生機制尚未完全闡明，多位學者［10，11］研究顯示子宮內膜蛻膜化異常會導致“漣漪效應”，導致胎盤異常、胎兒發育遲緩、子癇前期和早產等不良妊娠結局。在子宮蛻膜化中PR至關重要，而且ER和PR在胚胎植入的發生中均不可或缺［12］。因此，本研究著重探討了ER、PR與高齡及不良妊娠結局的關系。

3.1 ER、PR相關性及二者與高齡的相關分析本研究中發現蛻膜中ER與PR呈弱的正相關。Hewitt等［13］學者發現不僅ER的表達水平與E2作用相關，PR的表達也與E2水平相關。Ran［14］學者發現Shp2d/d小鼠子宮PR表達顯著降低，與子宮基質中ERα激活受限有關，同時ER靶基因，包括胰島素樣生長因子1（Igf1）和表皮生長因子受體（ErbB-1）在Shp2d/d子宮中的表達也降低。提示PR和ER的表達可能存在某種程度的正相關關系，與本研究結論大致相同。

本研究發現不論按同一妊娠結局比較，還是總體比較，高齡組孕婦分娩后蛻膜中ER、PR水平較年輕組均顯著下降。與大多學者的結論是一致的，如Woods等［1］發現在高齡雌鼠蛻膜異常表達的基因中，超過50%的失調基因均有雌激素受體Esr1和/或Pgr的結合位點，提示它們可能被雌激素或孕酮調控。Niklaus［15］和Gul［16］等均研究表明女性子宮中PR表達與年齡呈負相關。

3.2 ER、PR與妊娠結局的相關分析本研究發現不良妊娠結局組中ER、PR表達水平較正常結局組低，差異有統計學意義。與大多數學者研究結論一致，Langmia等［17］研究表明PR基因和表達水平下降與早產有關，推測可能是PR介導作用的喪失促使宮頸發生結構重建，常駐巨噬細胞增加，從而誘發早產［18］。有學者［19］研究發現胎盤中ESR1表達的降低以及ESR2和PGR蛋白的失活與先兆子癇的發病有關。結合既往文獻，推測機制可能是ER、PR表達下降影響胎盤灌注及其分泌功能，從而導致子癇前期的發生。Kleiblova等［20］研究發現GDM患者皮下脂肪中ER較正常孕婦的表達降低，但胎盤中ER表達未見明顯差異。Piltonen［21］等研究發現多囊卵巢綜合征婦女子宮內膜基質細胞PR呈下降趨勢，子宮蛻膜化反應受損，進而導致胎盤受損，發生不良妊娠結局。有學者［22］發現胎盤合體滋養層細胞中ERβ表達的下降與IUGR有關，可能與其導致NO輸出降低，滋養細胞侵襲受損有關。但本研究也與部分學者研究結論不一致，有學者［23］發現PR-/-雌性大鼠比PR+/+的快速血糖偏低；有學者［24］曾對卵巢切除的孕鼠，予以維持妊娠的最低劑量孕激素刺激，發現PR受體表達率最高的胎盤基底區總重量以及胚胎重量均下降。暫未查詢到關于新生兒窒息與ER、PR的相關研究，本研究中高齡與年輕組中新生兒窒息例數僅為1，可比性不大，有待擴增樣本量后進一步探討。本研究提示高齡組不良妊娠較正常妊娠發生率顯著升高，而相同年齡段不良結局組ER、PR表達水平較正常妊娠結局組稍低，但無統計學差異。可能與同年齡段兩組各自樣本量小相關，還可能與不良妊娠結局一般是多因素多機制及多通道共同作用所致有關［6］。

綜上所述，高齡孕婦不良妊娠發生率升高的原因之一可能與高齡所致ER、PR減少有關。我們可以進一步擴大樣本量研究高齡孕婦孕早期蛻膜組織中ER、PR對妊娠結局的影響。鑒于母胎界面上的激素—細胞因子網絡對免疫耐受起重要作用，且Paolino等［25］學者在Nature上發表的研究表明性激素可能通過RANK調控胸腺，從而影響母體免疫及代謝功能，導致流產、妊娠期糖尿病等的發生。我們可以通過動物實驗進一步探討ER、PR與免疫相關因子對蛻膜化和妊娠結局的影響，探討其作用機制，為臨床改善高齡孕婦不良妊娠結局提供理論依據。