梔子根結線蟲病的病原鑒定

陸秀紅 黎達境 黃金玲 李紅芳 張禹 劉志明

摘 ?要：為明確廣西賀州市梔子根結線蟲病病原種類，采集根部有明顯根結的梔子根系進行根結線蟲分離鑒定，通過觀察根結線蟲2齡幼蟲、雌成蟲、會陰花紋特征對其進行形態(tài)學鑒定，并利用核糖體ITS區(qū)和28S rDNA D2D3區(qū)序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析方法對其進行分子生物學鑒定。結果表明，該病原線蟲2齡幼蟲和雌成蟲形態(tài)特征及形態(tài)測量值與象耳豆根結線蟲（Meloidogyne enterolobii Yang ?Eisenback， 1983）相似;該病原線蟲核糖體ITS區(qū)與NCBI數(shù)據(jù)庫中象耳豆根結線蟲相應序列的相似度為100%，28S rDNA D2D3區(qū)與NCBI數(shù)據(jù)庫中象耳豆根結線蟲相應序列的相似度為99%以上;該病原線蟲核糖體ITS序列以99%的支持率與象耳豆根結線蟲聚為同一分支。綜合形態(tài)學和分子生物學鑒定結果將廣西賀州市梔子根結線蟲病病原種類鑒定為象耳豆根結線蟲，梔子（Gardenia jasminoides Eills）是該線蟲的新寄主紀錄。

關鍵詞：梔子;象耳豆根結線蟲;種類鑒定

Abstract： In order to clarify the pathogen species of Gardenia jasminoides Eills root-knot nematode disease in Hezhou， Guangxi Province， the root samples with obvious root-knot of G. jasminoides were collected for isolating root-knot nematodes. The pathogenic nematodes were identified by observing the morphological characteristics of females， second-stage juveniles and perineal pattern， sequence alignments， phylogenetic analysis. The results showed that the morphological characteristics and morphometric values of the second-stage juveniles and females were similar to those of Meloidogyne enterolobii Yang ?Eisenback. The rDNA-ITS fragment and 28S rDNA D2D3 fragment of the nematode were highly similar to those M. enterolobii in NCBI database， with a similarity of 100% and over 99%， respectively. The rDNA-ITS sequences of the nematode were clustered within the same clade and M.enterolobii with support rate of 99%. Morphological and molecular identification methods identified the pathogen species of G. jasminoides root-knot nematode disease in Hezhou as M. enterolobii. M. enterolobii is the new host for G. jasminoides Eills.

Keywords： Gardenia jasminoides Eills; Meloidogyne enterolobii Yang ?isenback; identification

植物寄生線蟲（plant parasitic nematodes， PPNs）是制約全球糧食生產(chǎn)的重要因素之一。據(jù)統(tǒng)計，全世界因植物寄生線蟲造成的損失約800億美元，其中根結線蟲（Meloidogyne spp.）廣泛分布于世界各地，是危害極大的一類植物寄生線蟲[1-2]。目前根結線蟲的防治措施包括種植抗病品種、使用化學殺線劑、輪作、生物防治等，其中線蟲種類鑒定是各類防治措施實施的基礎[3]。

梔子（Gardenia jasminoides Eills）又名黃梔子，屬茜草科（Rubiaceae Juss）梔子屬植物，是我國傳統(tǒng)的中藥材，不僅可以直接入藥，其果實還是提取食用色素添加劑“黃色素”的天然優(yōu)質材料。梔子分布于廣西、河南、浙江、江西、福建、湖北等地，種植梔子可促進產(chǎn)地農(nóng)民增收，是目前廣西賀州、柳州等地產(chǎn)業(yè)扶貧的有效途徑[4]。然而，梔子生產(chǎn)面臨嚴重的病害問題，其中根結線蟲病是其中一種重要的病害，在不同地區(qū)均有不同程度發(fā)生。熊英等[5]、賈全全等[6]、李冬等[7]等相繼在廣西柳州、江西等地發(fā)現(xiàn)該病害，但多數(shù)研究集中于病害發(fā)生情況調查及藥劑篩選方面，病原相關報道較少，僅有廣西柳州[5]、福建福鼎[8]兩地對其病原進行了鑒定。2018—2020年對廣西賀州市的梔子種植基地進行調查，發(fā)現(xiàn)梔子受到根結線蟲的危害，呈現(xiàn)植株長勢差，葉片黃化、萎蔫、根系形成大量根結等癥狀，嚴重制約當?shù)貤d子種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究對采集到的梔子根系及其根際土壤進行分離，對分離得到的根結線蟲二齡幼蟲及雌蟲進行形態(tài)觀察及分子生物學鑒定，旨在明確梔子根結線蟲病病原種類，為該病的有效治理提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?供試線蟲的采集及分離

線蟲樣本采自賀州市八步區(qū)蓮塘鎮(zhèn)旗頭嶺（22°491.21 N，108°2159.55 E）文坡村、上寺村梔子種植基地，采用五點取樣法挖取呈現(xiàn)根結線蟲病癥狀的梔子根系及其根際土壤帶回實驗室。在解剖鏡下，從根結挑取單卵塊放置25?℃恒溫箱孵化成二齡幼蟲，將二齡幼蟲接種于預先培植于消毒土的梔子（賀梔1號）根部，進行活體保存，待用。試驗時挖取根結線蟲病癥狀明顯的梔子根系及根際土壤，采用直接解剖法分離雌蟲，將根系置于體視鏡（NIkon SMZ800N）下用3號昆蟲針挑取雌蟲進行形態(tài)學觀察;根際土壤采用改良貝曼漏斗法進行分離，25?℃靜置24?h后，用小玻璃瓶收集約10?mL線蟲懸浮液。在體視鏡下將根結線蟲二齡幼蟲從線蟲懸浮液中挑出，經(jīng)熱殺死（65?℃水浴3?min）后制成臨時玻片用于形態(tài)觀察。

1.2 ?形態(tài)學鑒定

二齡幼蟲及雌蟲主要形態(tài)特征：使用尼康顯微鏡（NIkon Ni-E）觀察其頭部、口針、尾部特征，并采用de Man公式對20條二齡幼蟲進行測量，分別測量體長、最大體寬、口針長度、尾長、透明尾長和DGO（背食道腺開口至口針基部球的距離）等形態(tài)指標[9]。

會陰花紋的制作及觀察：參照張紹升[10]的方法，從梔子根組織挑取成熟雌蟲，放置滴有10?μL 40%乳酸的載玻片上，在體視顯微鏡下用手術刀切取蟲體后部約1/4并將體內組織去除，用鑷子將會陰花紋轉移至滴有10?μL純甘油的載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察拍照。

1.3 ?分子生物學鑒定

1.3.1 ?線蟲DNA提取 ?線蟲DNA抽提采用單條線蟲DNA提取法。參照王江嶺等[11]的方法略有改動，在經(jīng)滅菌的凹面皿上滴入16?μL ddH2O和2?μL 10×PCR Buffer混合液，用挑蟲針將單條根結線蟲二齡幼蟲挑入混合液中，取1號昆蟲針將線蟲切成2～3段，用移液器將含有線蟲段的所有混合液轉移至200?μL PCR管中，加入2?μL（1?mg/mL）蛋白酶K，–80?℃超低溫冰箱放置20?min，65?℃溫育60?min，95?℃加熱10?min，獲得DNA提取液。DNA提取液可立即用于PCR擴增或放入–20?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ?PCR擴增 ?核糖體ITS區(qū)采用引物F194： 5-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3和PXB481： 5-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3進行擴增[11]，28S rDNA D2D3區(qū)采用通用引物D2A： 5-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGT-3和D3B： 5-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3進行擴增[12]。PCR反應體系（50?μL）：TaKaRa Taq?HS Perfect Mix （2×） 25?μL，上游引物（10?μm）2?μL，下游引物（10?μm）2?μL，模板DNA 2?μL，ddH2O 19?μL。擴增條件：94?℃ 4?min;94?℃ 40?s，55?℃ 40?s，72?℃ 1?min，共35個循環(huán);最后72? 5?min。PCR產(chǎn)物進行1% Agarose膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物純化后，送生工生物工程（上海）股份有限公司雙向測序。

1.3.3 ?序列分析 ?PCR產(chǎn)物測序結果用NTI 11軟件進行序列拼接，最終序列上傳至GenBank，序列號分別為MH756121、MH756122、MN648519、MN648520。根據(jù)近年來發(fā)表的根結線蟲系統(tǒng)進化文獻，從GenBank下載相關線蟲rDNA-ITS和28S rDNA D2D3序列，采用NTI 11軟件進行多重序列比對分析。

1.3.4 ?系統(tǒng)進化分析 ?采用MEGA 7.0軟件構建基于rDNA-ITS及28S rDNA D2D3區(qū)的Neighbor- joing系統(tǒng)進化樹。分別選擇GenBank數(shù)據(jù)庫中象耳豆根結線蟲（M. enterolobii）rDNA-ITS序列（MT648507、MT193450、MT193449、MN017119、MN017115、MH800969）和28S rDNA D2D3區(qū)序列（MT648507、MT193450、MT193449、MN017119、MN017115、MH800969），南方根結線蟲（M. incognita）rDNA-ITS序列（LC030363），花生根結線蟲（M. arenaria）rDNA-ITS序列（KJ572384、AF387092）和28S rDNA D2D3區(qū)序列（AF435803、KJ598135），爪哇根結線蟲（M. javanica）rDNA-ITS序列（AY438555、KX646187）和28S rDNA D2D3區(qū)序列（MT3412999、MN096736），巴拉那根結線蟲（M. paranaensis）28S rDNA D2D3區(qū)序列（AF435800、KY911103），擬禾本科根結線蟲（M. graminicola）28S rDNA D2D3區(qū)序列（MG273441、MG273443），分別以朱頂紅短體線蟲（Pratylenchus hippeastri， FJ712935）和玻利維亞短體線蟲（P. crenatus， MH973647）作為外類群，rDNA-ITS共計15條序列，28S rDNA D2D3區(qū)共計17條序列構建系統(tǒng)進化樹，以自展法（bootstrap）進行1000次循環(huán)檢測[13-14]。

2 ?結果與分析

2.1 ?梔子根結線蟲病癥狀

調查發(fā)現(xiàn)賀州市梔子種植基地部分梔子出現(xiàn)植株矮小，葉片黃化失綠，生長緩慢，嚴重的整株枯死等癥狀。受害植株根部形成大小不一的根結，根部表面壞死呈疏松孔狀（圖1）。取根組織在體視顯微鏡下觀察可見大小不一的卵囊，切開卵囊見橢圓形卵塊，根結組織內發(fā)現(xiàn)梨形的雌蟲。采用改良貝曼漏斗分離根際土壤可分離到大量根結線蟲二齡幼蟲。

2.2 ?形態(tài)學特征

雌蟲：蟲體乳白色，梨形;頸部突出，與體分界明顯;陰門和肛門位于末端;會陰部為指狀花紋;側尾腺口點狀，位于肛門兩側靠前位置;口針細長，椎體部向背面略彎曲與桿部等長;口針基部球較小，形成兩個球狀。中食道球卵圓形，瓣門近似圓形;排泄孔位于中食道球前口針基部稍后位置（圖2A）。會陰花紋近卵圓形或橢圓形;背弓較高，線紋較細且平滑，外側線紋呈波浪狀;具1～2條不太明顯側線;陰門裂較長，陰肛區(qū)無線紋;腹面線紋纖細光滑，尾部較明顯（圖2B）。

二齡幼蟲：線形，身體體環(huán)清晰明顯，頭架骨化弱，唇區(qū)縊縮不明顯;排泄孔位于半月體后;口針細長，基部較大且為圓球形;中食道球卵圓形;尾部透明區(qū)分界明顯，尾部縊縮明顯，尾尖鈍圓或細圓（圖3），其測量值見表1。

本研究中廣西賀州種群形態(tài)特征和測量值與象耳豆根結線蟲（M. enterolobii）原始報道基本一致，故定為象耳豆根結線蟲[15]。

2.3 ?分子特征

利用通用引物F194/PXB481和D2A/D3B分別對二齡幼蟲核糖體ITS區(qū)域及28S rDNA D2D3區(qū)進行擴增，得到約700?bp的片段，PCR產(chǎn)物擴增如圖（圖4）。經(jīng)雙向測序和拼接獲得ITS片段大小為757?bp，GenBank登錄號為MH756121、MH756122，與國內報道的福建、湖南、海南及越南象耳豆根結線蟲（M. enterolobii）群體的序列相似度是100%;與近似種南方根結線蟲（M. incognita）ITS（MH113856）的序列相似度為90%，與花生根結線蟲（M. arenaria）ITS序列（LC030356、LC030350）的序列相似度分別為88%和90%;與爪哇根結線蟲（M. javanica）ITS序列（AY438555、KX646187）的序列相似度均為88%。擴增的28S rDNA D2D3區(qū)片段大小分別為764?bp和716?bp，GenBank登錄號為MN648519和MN648520，其中MN648520與國內報道的廣東、福建，及美國、泰國象耳豆根結線蟲（M. enterolobii）群體的序列相似度為100%，MN648519與美國象耳豆根結線蟲（M. enterolobii）群體的序列相似度為100%，和中國福建、廣東及泰國象耳豆根結線蟲（M. enterolobii）群體的序列相似度為99%;MN648519與近似種花生根結線蟲（M. arenaria）和爪哇根結線蟲（M. javanica）D2D3區(qū)片段（AF435803、MT3412991）的序列相似度均為94%;MN648520與花生根結線蟲（M. arenaria）和爪哇根結線蟲（M. javanica）D2D3區(qū)片段（AF435803、MN096736）的序列相似度分別為95%和94%。該結果進一步表明該病原線蟲為象耳豆根結線蟲（M. enterolobii）。

2.4 ?系統(tǒng)進化樹分析

對基于核糖體ITS和28S rDNA D2D3區(qū)構建的系統(tǒng)進化樹進行分析發(fā)現(xiàn)，基于ITS基因序列的進化樹中，梔子根結線蟲種群MH756121、MH756122與海南（KF418369、MT0675599）、越南（MG773551、MG773550）、福建（MT209951、KX823380）、湖南（MT456216）7個象耳豆根結線蟲（M. enterolobii）群體位于同一分支，支持率為99%。基于28S rDNA D2D3基因序列的進化樹中，梔子根結線蟲種群MN648519、MN648520與泰國（MT648507）、中國福建（MT193450、MT193449）、中國廣東（MN017119、MN017115）、美國（MH800969）6個象耳豆根結線蟲（M. enterolobii）群體位于同一分支上，支持率為85%。此外，基于核糖體ITS和28S rDNA D2D3區(qū)域構建的系統(tǒng)進化樹中，梔子根結線蟲種群均與南方根結線蟲（M. incognita）、花生根結線蟲（M. arenaria）、爪哇根結線蟲（M. javanica）、擬禾本科根結線蟲（M. graminicola）等近似種聚類在不同的分支，能明顯與近似種區(qū)分開（圖5，圖6）。該結果進一步證實該病原線蟲為象耳豆根結線蟲（M. enterolobii）。

3 ?討論

本研究對廣西賀州市梔子種植基地的根結線蟲病進行了調查，發(fā)現(xiàn)梔子根結線蟲病發(fā)生較嚴黑體為新獲得的序列標記。本研究采用形態(tài)學結合分子生物學的方法，將其病原鑒定為象耳豆根結線蟲（M. enterolobii），為梔子根結線蟲病的診斷及防治奠定了基礎。

根結線蟲病是梔子生產(chǎn)面臨的一種重要病害，廣東[16]、福建[8]、江西[6-7]等地相繼報道了該病害，但多數(shù)研究集中于病害發(fā)生情況調查及藥劑篩選方面，病原相關報道較少，僅有廣西、福建兩地對其病原進行了鑒定。2008年，熊英等[5]采用形態(tài)學的方法將廣西柳州市鹿寨縣黃梔子種植基地根結線蟲病的病原鑒定為南方根結線蟲（M. incognita）。福建省林業(yè)職業(yè)技術學院和福建省林業(yè)科學院將該省梔子根結線蟲病的病原鑒定為花生根結線蟲（M. arenaria）[8]。根結線蟲分布廣且種類繁多，該屬有近100個有效種，同種作物不同地區(qū)其優(yōu)勢種群有差異[1]。許天委等[17]研究發(fā)現(xiàn)海南省土沉香根結線蟲病的病原為南方根結線蟲（M. incognita）、花生根結線蟲（M. arenaria）、爪哇根結線蟲（M. javanica ），其中南方根結線蟲（M. incognita）是優(yōu)勢種群;而蘇圣淞等[18]對海南澄邁土沉香根結線蟲病病原鑒定發(fā)現(xiàn)其病原為象耳豆根結線蟲（M. enterolobii）。本研究對廣西賀州市梔子根結線蟲病的病原進行鑒定發(fā)現(xiàn)其病原為象耳豆根結線蟲（M. enterolobii），這樣的結果并不矛盾。本研究在之前形態(tài)學鑒定的基礎上結合了分子生態(tài)學特征進行分析，其結果具有更高的準確性。

1983年，Yang等[15]在我國海南省儋州市象耳豆樹上首次發(fā)現(xiàn)并報道象耳豆根結線蟲（M. enterolobii），此后許多國家相繼報道了該線蟲的發(fā)生，到目前為止發(fā)現(xiàn)象耳豆根結線蟲（M. enterolobii）廣泛分布于四大州的熱帶地區(qū)[19]。在我國，海南省[20]的三亞、瓊海、定安，廣東省[21]的番禺、遂溪，福建省[22]的福州、漳州，湖南永州[23]等地均發(fā)現(xiàn)了該線蟲。研究發(fā)現(xiàn)該蟲可危害中藥材、蔬菜、果樹等經(jīng)濟作物造成嚴重的經(jīng)濟損失，本研究發(fā)現(xiàn)的茜草科梔子是該線蟲的寄主新記錄。卓侃等[21]認為該線蟲寄主范圍廣、毒性強、危害大，是熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的病原線蟲。廣西地屬亞熱帶地區(qū)，廣泛種植的西瓜、番茄、番石榴等作物均是象耳豆根結線蟲的寄主，開展該線蟲的調查，了解其分布情況及新的潛在寄主，可為有效采取檢疫和防治措施，防止該病原線蟲的傳播擴散及危害提供必要的依據(jù)。

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責任編輯：謝龍蓮