橡膠樹NIPs通道蛋白的生物功能分析

史翔宇 龍翔宇 方永軍 陽江華 肖小虎 秦云霞

摘 ?要：根瘤素26-like內在蛋白（nodulin 26-like intrinsic proteins， NIPs）是水通道蛋白（aquaporin protein， AQP）中一個植物特有的亞類，主要定位在質膜或內質網膜上，負責轉運不帶電荷的類金屬溶質如硼、甘油、尿素、硅、砷、H2O2、NH3等，在植物營養獲取或脅迫應答過程中發揮著重要作用。本研究以擬南芥NIPs序列為參照，利用多種生物信息學軟件，對橡膠樹7個HbNIPs的基因結構、蛋白理化性質、聚類分析、組織表達及割膠處理的應答進行綜合分析。根據分析結果可以初步推斷：7個HbNIPs應是有功能的轉運蛋白，它們不但具有AQP典型的跨膜結構域（4～6個），保守的NPA基序和關鍵的ar/R篩選氨基酸，而且從聚類的結果可以推斷它們具有轉運硼酸、尿素和乳酸的功能。另外，從其啟動子調控元件、表達分析和翻譯后修飾分析可知，它們的活性及表達具有受發育階段、多種激素和磷酸化修飾的嚴謹調控。該初步結果有助于進一步研究橡膠樹NIP家族基因的功能及其在橡膠樹創新育種中的應用。

關鍵詞：橡膠樹;根瘤素26-like內在蛋白;水通道蛋白;類金屬元素

Abstract： Nodulin 26-like intrinsic proteins （NIPs） are one subclass of plant specific aquaporin protein （AQP）， mainly located at cytoplasm or endoplasmic reticulum， in charge of exchange metalloids such as boron， silicon， arsenic， selenium， glycerol， carbamide， H2O2， NH3 etc.， which are indispensible for plant microelement nutrition and stress responses. In this study， seven NIPs homologues of Arabidopsis were screened out on the rubber tree whole genome level， then bioinformations of their gene structure， protein domains and motifs， promter cis-acting elements and expression characteristics were in-depth analyzed through on-line softwares and PRISM. Totally， the seven HbNIPs were putative functional NIPs， because they owned all or partial typical characteristics of AQPs and clustered together with the homologues， such as typical domains for transmembrane， conservative NPA motifs and key ar/R amino acid for substrate determination. From the phylogenetic analysis results， they were predicated to be possibly involved in metalloids assimilation such as boron or glycerol， or lactate. In addition， from the analyses of cis-acting elements in the promoters， expression profiles and post-translational modifications， it is obvious that the activities would be critically regulated by development stages or hormones or phosphorylation. The primary results would benefit for further study on the function and utilization in rubber trees innovative breeding.

Keywords： Hevea brasiliensis; nodulin 26-like intrinsic proteins; aquaporin protein， AQP; metalloid

水通道蛋白（aquaporin protein， AQP）的重要性已經為人們所熟知，它們通過調節水分的吸收和轉運，能夠快速調節細胞體積、滲透壓等，維系著細胞的生命和整個植物的水分平衡。它們如此重要而不斷進化為成員眾多，功能多樣的主要內在蛋白MIP（major intrinsic protein）大家族。依據其亞細胞定位及氨基酸序列的同源性分為4大亞類：質膜內在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins， PIPs），液泡膜內在蛋白（tonoplast intrinsic proteins， TIPs），根瘤素26-like內在蛋白（NOD26-like Intrinsic Proteins， NIPs）以及小分子堿性內在蛋白（small basic intrinsic proteins， SIPs）[1]。

根瘤素26-like內在蛋白（NOD26-like Intrinsic Proteins， NIPs）作為水通道蛋白AQP家族的一個大亞類，編碼一類鑲嵌式膜蛋白，形成讓特異底物雙向通過的選擇性運輸通道，主要轉運一些不帶電荷的小分子。與其他AQP蛋白亞類相同的是，NIPs同樣以多基因家族的形式廣泛存在于植物細胞中，家族成員較多;與其他AQP蛋白亞類不同的是，NIPs對水的透過率低或不透過水，而是轉運一些其他非金屬物質如硼酸、硅酸、甘油、硒和砷等，還有其他物質包括甲酰胺、尿素、甘油以及氣體如氨氣、過氧化氫H2O2等[2-9]。結構上，NIPs通過通道孔徑及4個朝向膜內部的氨基酸組成的芳香族氨基酸/精氨酸（aromaticar ginine， ar/R）選擇性過濾結構，嚴謹地選擇通過底物的特異性[10-11]。目前已報道的NIPs擬南芥中有9個[8]、水稻10個[12]、玉米5個[13]、小麥4個[14]、大豆14個[15]，其中擬南芥AtNIP5;1參與硼的高效吸收與轉運，AtNIP6;l是負責將硼轉運到生長中心后再分配[16-17];AtNIP1;1、AtNIP1;2、AtNIP5;1、AtNIP6;1、AtNIP7;1和OsNIP1;1都能轉運砷[8-9，18-22];AtNIP1;2轉運鋁[23];OsNIP2;1轉運硅[24]等。應用方面，過表達小麥TaNIP可增強植株耐鹽性[25]，而敲除水稻OsNIP3;1則使水稻因缺硼而生長發育嚴重受損[26]。因此科學家計劃培育優質品種能夠多吸收有益元素硒、硼、硅，不吸收或少吸收有毒砷或重金屬鎘等水稻品種，挖掘NIPs功能對于優質品種的分子改良具有重要意義[27]。

天然橡膠主要來源于巴西橡膠樹，是一種重要的戰略物資和工業原料。橡膠樹在生長發育過程中的營養供給及割膠后脅迫清除的效率關系著其健康與豐產性。硼是橡膠樹不可或缺的微量元素，缺硼時，葉片縮小變形;尤其是橡膠樹開割后，隨著膠乳的排出，整個排膠面內細胞代謝都被激活，水分、甘油、氮素、氨基酸等多種物質在乳管細胞間的轉運，pH的制衡，H2O2等活性氧的產生與消除效率等都會影響膠乳再生效率[28-32]，水通道蛋白家族的功能挖掘逐漸成為研究熱點。目前已報道的7個橡膠樹AQP基因[28-32]，4個基因屬于PIP家族，3個屬于TIP家族，它們在受到乙烯利處理后，不同基因在韌皮部或乳管中轉錄水平有比較大的變化[29]，推測乙烯是通過影響這些基因的表達而調控著木質部和韌皮部的水分循環，增加了排膠總量[33]，而NIP家族基因的功能尚未見報道。

本研究以擬南芥NIPs序列為參照，通過橡膠樹全基因組檢索，篩選到7個可能的NIPs，對橡膠樹NIPs的基因結構、蛋白理化性質和功能域等進行對比、聚類進化分析、以及基因組織表達及割膠處理的應答等方面進行系統分析，為發掘橡膠樹NIP蛋白的功能提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?橡膠樹NIP基因的篩選與分析

以擬南芥、水稻NIP家族基因序列信息為參考，在橡膠樹全基因組數據庫中檢索，去除冗余序列后，最終獲得7個可能的NIP基因，它們的ID分別為HbNIP7;1（scaffold0091_20327）、HbNIP4;1（scaffold0103_1585880）、HbNIP1;2（scaffold0050_1992929）、HbNIP1;1（scaffold0123_ 1472792）、HbNIP3;1（scaffold0513_732267）、HbNIP5;1（scaffold0655_509650）和HbNIP6;1（scaffold0946_68795）。比對NIPs的全長DNA序列和CDS序列，利用GSDS2.0軟件查詢7個HbNIP基因的內含子和外顯子構成，并進行基因結構解析;利用在線軟件ProtParam tool、ProtComp 9.0（亞細胞定位）、CDD數據庫、MOTIF、TMHMM Serverv.2.0和SOPMA等軟件分析了HbNIPs的理化特性、亞細胞定位、保守結構域、跨膜結構域及二級結構特征。采用在線軟件Netphos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/）預測HbNIPs可能的磷酸化位點。

1.2 ?橡膠樹、擬南芥和水稻NIP家族成員進化樹的構建

根據7個橡膠樹NIP家族基因的氨基酸序列和從GenBank數據中下載獲得的擬南芥和水稻NIP家族成員的氨基酸序列，利用DNAMAN進行氨基酸多序列比對，使用MEGA-X軟件和鄰接法（neighbor-joining，NJ）統計1000重復時，最近似的NIPs家族進化樹。

1.3 ?HbNIPs基因啟動子順式元件分析

下載HbNIPs各基因編碼區上游約1.5 kb的啟動子序列，利用在線軟件（PlantCARE）統計分析各基因啟動子區順式作用元件的數量和種類[34]。

1.4 ?橡膠樹7個NIPs基因的組織及表達分析

本課題組已建立的轉錄組數據庫是以橡膠樹高產品種‘熱研7-33-97品種為材料，構建了不同組織（膠乳、葉片、根、樹皮、雌雄花、種子、胚芽）、葉片的不同發育時期（古銅期、變色期、淡綠期、成熟期）、1.5%乙烯利處理不同時間（0、3、12、24 h）以及橡膠幼苗高低溫脅迫處理不同時間（4?℃/45?℃，0、6、12 h）的轉錄組數據庫。各個基因的表達以（Reads Per Kilobase per Million mapped reads， RPKM）均一化處理。利用此數據庫信息和PRISM數據分析軟件，獲得橡膠樹各HbNIPs基因的表達模式。

2 ?結果與分析

2.1 ?HbNIPs的鑒定及其結構特征

為全面了解HbNIPs的生物學特征，以擬南芥NIPs序列為參照，利用多種生物信息學軟件（軟件信息見1.1-1.3）對其進行全面分析。從其基因結構可知（圖1）：不同HbNIPs基因間的外顯子長度相似（除了HbNIP5;1的第一個外顯子和HbNIP1;2的一個8氨基酸的小外顯子外），內含子長度差異明顯，比如HbNIP6;1基因全長達到3371?bp而HbNIP3;1只有1249?bp。除了HbNIP1;2多添加了一個8氨基酸的小外顯子及HbNIP5;1被選擇性剪接為3個外顯子和2個內含子外，其他5個HbNIPs都含有5個外顯子和4個內含子。

亞細胞定位預測是：除了HbNIP7;1特異地定位于質膜上外，其他6個HbNIPs既可以定位于質膜上，也可以定位在內質網上（表1）。HbNIP7;1基因結構和亞細胞定位的差異暗示著選擇性剪接在HbNIPs基因家族進化中起著重要作用，有可能進化出新的功能。7個HbNIPs的基本生化特征是氨基酸長度為233～305?aa，相對分子量大小為24～32 ku，理論等電點pI 5.71～9.34，平均親水系數范圍是0.346～0.713;脂溶指數分析表明HbNIPs變動范圍為95.22～113.02（表2）。

結構特征（CDD在線軟件）和二級結構（SOMPA軟件）分析結果發現HbNIPs二級結構均存在α螺旋，延伸帶，β轉角和隨機扭曲，分布情況也相對一致，以α螺旋和隨機扭曲為主，占比超過74%（表1）。7個HbNIPs結構域保守，其中有4個含有6個跨膜結構域（TM1-TM6），HbNIP6;1沒有跨膜結構域TM3，HbNIP3;1沒有TM4，因而這2個蛋白只有5個跨膜結構域，HbNIP1;2只有4個跨膜結構域（不含有包括TM1和TM2）（圖2）。它們都含有2個典型的保守結構域NPA（Asn-Pro-Ala）motif，其中HbNIP5;1和HbNIP6;1中的NPA motif突變成NPS-NPV。（圖2）由于纈氨酸V和丙氨酸A同為不帶電荷的非極性氨基酸，所以NPV不會改變蛋白質的空間結構，而且其芳香族氨基酸/精氨酸所形成的選擇過濾結構（ar/R selectivity filter）具有植物NIPs保守的FA-AR氨基酸組成，所以底物的特異性也應該不會改變（圖2）。

總之，7個HbNIPs應是有功能的轉運蛋白，它們不但具有AQP典型的跨膜結構域（4～6個），保守的NPA基序和關鍵的ar/R篩選氨基酸，而且其蛋白的理化性質等多個參數與已知擬南芥、水稻的同源NIPs相近，因此推測它們的功能很可能會相似（擬南芥、水稻的同源NIPs的參數略），能夠分別特異地轉運不同的底物。

2.2 ?橡膠樹HbNIPs成員的生物學進化

為探尋HbNIPs的進化，與擬南芥AtNIPs和水稻OsNIPs一起構建了系統進化樹（圖3）。結果顯示HbNIPs與擬南芥AtNIPs的進化關系更為接近，初步表明其進化的保守性，如HbNIP1;1-2與AtNIP1;1-2、HbNIP4;1和AtNIP4;1-2、HbNIP5;1與AtNIP5;1、HbNIP6;1與AtNIP6;1、HbNIP7;1與AtNIP7;1等分別聚類在相近的進化分支上。然而，也有單子葉植物與雙子葉的擬南芥和高大喬木橡膠樹的成員聚在一起，例如水稻的OsNIP3;1與AtNIP5;1、HbNIP5;1、AtNIP6;1和HbNIP6;1聚在一起，而OsNIP2;1和OsNIP2;2、OsNIP4;1則單獨聚類在不同分支上，這表明部分NIPs功能的保守性和相似性，部分NIPs的功能分化晚于物種間的分化，聚類結果對于鑒定同源基因的功能具有重要的指導意義。

2.3 ?HbNIPs的調控特征

已有文獻表明水稻中的NIPs活性受磷酸化修飾調控。利用軟件Netphos 3.1 Server分析結果如下，HbNIPs氨基酸序列中存在很多個可能的磷酸化位點，預測分值大于0.5的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的數量（表3）。眾多磷酸化位點的存在預示著磷酸化調控很可能是調控HbNIPs活性的重要方式。

2.4 ?HbNIPs啟動子元件分析

HbNIPs基因啟動子分析統計結果表明：各個基因啟動子中具有應答多種逆境和激素的順式調控元件，數量差異很大而且各個基因的具有偏好性（表4）：比如與光感知應答有關的LR（light responsive）元件53個;HbNIP4;1有與無氧脅迫相關的ARE（anaerobic induction）元件4個;HbNIP7;1中有4個CGTCA（甲基茉莉酸應答元件）等、與干旱有關的MBS元件與防御脅迫（defense and stress responsiveness）有關的TC-rich repeat元件;還有其他激素應答元件：TGA（生長素）、ERE（乙烯利）、P-box或者TATC-box（赤霉素）、ABRE（脫落酸）和TCA（水楊酸）。這些信息暗示HbNIPs的功能參與橡膠樹逆境脅迫應答，其表達受到多種激素協同調控。

2.5 ?HbNIPs基因的組織表達及隨葉片發育的表達特征

HbNIPs在膠乳、樹葉、根、樹皮、雌花、雄花和種子等7個組織中的表達分析結果（圖4A）表明：它們組織表達模式各不相同。HbNIP3;1、HbNIP4;1和HbNIP7;1在7種組織中表達量都很低幾乎檢測不到，而HbNIP1;1、HbNIP1;2、HbNIP5;1和HbNIP6;1四個基因的表達水平較高些而在各個組織中各有偏重，其中HbNIP5;1在葉、根、雄花、雌花4個組織中都是優勢表達的基因;HbNIP1;2在樹皮中表達最高;HbNIP1;1在種子中表達最高;在膠乳中只有HbNIP1;1、HbNIP1;2、HbNIP3;1和HbNIP6;1有表達，相比起來，HbNIP1;2是表達最高的，其他3個基因表達量很低。利用乙烯利增產實驗進一步分析這4個基因的表達特征（圖4C），結果表明，這4個基因受誘導后轉錄水平變動幅度不大，但是HbNIP1;1在乙烯利處理后的12 h內，膠乳表達呈上升趨勢，而HbNIP6;1呈下降趨勢，而在處理12 h后，二者的表達漸近恢復。

另外，對4個在葉片中表達量高的基因成員HbNIP1;1、HbNIP1;2、HbNIP5;1和HbNIP6;1進一步分析了它們隨葉片發育（4個時期—古銅期、變色期、淡綠期和成熟期）的表達情況，同時也分析了它們是否受高低溫處理誘導表達。結果表明：3個基因呈現出快速遞增的表達，HbNIP1;2和HbNIP6;1在淡綠期最高，HbNIP1;1在變色期和淡綠期較高，HbNIP5;1在成熟期表達最高。總之，各個成員的差異表達表明其功能的時空差異性和功能特異性（圖4B）。另外，這4個基因總體上是受低溫的誘導影響小于高溫處理，在低溫處理12 h后，它們的表達都比處理前略微下降;而HbNIP5;1和HbNIP6;1隨著高溫處理，表達量迅速下調2倍，HbNIP1;2則有增加趨勢（圖4D）。

3 ?討論

3.1 ?HbNIPs具有植物NIPs典型的組成特征，推斷是橡膠樹中有功能的NIPs蛋白

HbNIPs具有植物NIPs典型的組成特征，而且聚類在一起，推斷其在橡膠樹中發揮著相似的功能。本研究在橡膠樹全基因組水平上檢索出7個NIPs，通過對比分析發現其基因結構、理化性質和聚類都與其同源基因相似，比如橡膠樹的HbNIP5;1和HbNIP6;1中的2個NPA motif進化為NPS-NPV，與擬南芥AtNIP5;1和AtNIP6;1一致，因此推測二者很可能會參與硼酸的吸收和轉運。在橡膠樹中各個組織中表達分析表明：7個HbNIPs的組織表達量都比較低，其中HbNIP1;1、HbNIP1;2、HbNIP5;1與HbNIP6;1四個基因的表達水平較高些，它們在各個組織中各有偏重而且隨著葉片發育而改變（圖4B），這與其他AQP的NIPs亞家族成員的基因表達水平相對低，而且一些NIPs常常在一些特化的細胞或器官中表達是一致的。乳管中的表達情況：橡膠樹NIPs在膠乳中表達水平低（圖4A、C），且它們受乙烯利處理后受誘導變化小，因此推測橡膠樹NIPs的主要功能很可能不是負責木質部和韌皮部的水分運輸而是主要轉運特殊的溶質比如硼、乳酸等。例如在樹皮、雄花和雌花部位表達量較高的HbNIP1;2，是AtNIP2;1的同源蛋白，很可能其功能是選擇性轉運乳酸，有利于更好地適應低氧環境[35]。由于橡膠樹乳管中和莖干內無氧代謝活躍[36]，因此與AtNIP2;1聚在一組的HbNIP1;2很可能也參與乳酸的代謝和利用，這個與這個基因的啟動子含有ARE無氧應答元件是一致的（表4）。另外，從進化分析推斷（圖3），如橡膠樹HbNIP1;1、HbNIP1;2與擬南芥AtNIP1;2在同一進化分支上，推測其可能參與鋁元素的脅迫過程[23];橡膠樹HbNIP7;1和擬南芥AtNIP7;1在同一進化分支上，推測其可能提高砷元素脅迫的耐受性[37-38];橡膠樹HbNIP5;1、HbNIP6;1與擬南芥AtNIP5;1和AtNIP6;1及水稻OsNIP3;1在同一個進化分支上，推測其可能參與硼酸的轉運過程[39]。硼是花粉管生長、受精和信號傳遞等過程中必不可少的微量元素[40-41]，推測這2個基因可能在橡膠樹花器官內硼酸轉運中發揮作用。

3.2 ?HbNIPs可能的調控方式與利用

已有的文獻表明：AQP的功能受多種調控方式的影響，包括糖基化修飾、磷酸化修飾等，比如質膜上的OsNIP1;1[42]、大豆的GmNOD26[43]等受多種蛋白激酶CDPKs調控。吳偉等[15]啟動子元件分析表明多數NIPs含有響應多種脅迫和激素應答元件，推斷它們的功能會受多種調控而參與植物脅迫應答。我們對橡膠樹HbNIPs啟動子元件分析中發現，它們除了包括多種激素應答元件外，還具有甲基茉莉酸、無氧，光應答元件等?？傊?，根據綜合分析，HbNIPs的活性及表達具有受發育階段、激素及翻譯后修飾等嚴謹控制，推測其主要功能不是或不僅是轉運水，更重要的是轉運尿素、甘油、硼等物質，通過調控參與營養物質吸收、轉運和利用或脅迫防御，其分子機理還需要進一步去實驗證實。該研究結果為進一步鑒定橡膠樹NIP家族功能的挖掘和利用奠定基礎。

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