基于磁性納米粒子的免疫熒光法測定 花生中的黃曲霉毒素B1

◎ 陶 燕，康雪梅，李 超，趙雪峰，曹靜杰，賈松濤，李夢雨，趙林萍

（河南中標檢測服務有限公司，河南 鄭州 450001）

黃曲霉毒素（AFs）是自然界中黃曲霉和寄生曲霉屬真菌產生的有毒代謝物。有一系列不同類型的AFs，AFB1和AFG1（黃曲霉毒素G1）毒性最強，食用受污染的谷物或動物產品可能影響人體健康。據(jù)報道，AFB1具有致癌作用，是一種免疫抑制劑，即對人體有致癌作用。因此，迫切需要一種高選擇性的AFB1檢測方法。

黃曲霉毒素分析方法有很多，有研究[1]對樣品預處理和分析方法進行了分類，免疫親和或多純化柱是儀器分析常用的材料，如高效液相色譜、氣相色譜和液相色譜。這些方法要求實驗室設備完善，耗時且昂貴。AFB1的檢測方法和商業(yè)試劑盒有很多，免疫化學方法已成功用于食品和飼料中AFB1的檢測。YU等[2]發(fā)現(xiàn)AFB1酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）的檢測限 （LOD）為10 pg·mL-1和90 pg·mL-1。ELISA可 能出現(xiàn)假陽性或陰性，常有基質干擾，且檢測時間很長。近年來，納米材料已廣泛應用于免疫分析的開發(fā)。納米顆粒已被用作固定化生物分子的支撐材料或作為示蹤劑獲得擴增檢測。磁性微球具有良好的生物相容性，反應后易于從反應溶液中分離。目前，已經(jīng)開發(fā)出利用金納米顆粒對AFB1進行磁性比色免疫分析，WANG等[3]描述了一種檢測AFB1的競爭性方法，在樣品中的AFB1和涂上AFB1-BSA的磁性微球間進行競爭性結合，該方法已應用于玉米樣品檢測。但上述描述的方法都由許多組件和步驟組成，成本較高，且準備工作較長，當在分析中使用多組件時，會產生不正確結果的風險，因此，急需一種快速、簡單的AFB1測定方法。

本文提出了一種快速、靈敏的基于MNP的AFB1免疫熒光檢測方法，該方法僅由兩種成分組成，即涂有MNPs的多克隆抗AFB1抗體和AFB1-BSA-FITC熒光偶聯(lián)物。該方法滿足了用戶的3個主要要求：樣本量小、AFB1檢出限低、檢測時間短。

1 材料與方法

1.1 材料

黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B1-BSA偶聯(lián)物、熒光素5（6）-異硫氰酸酯、二甲基甲酰胺、Sephadex G25培養(yǎng)基、2-氨基-2-（羥甲基）-1,3-丙二醇（Tris）、NaCl、（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）、兔分離抗血清產生的多克隆抗黃曲霉毒素B1抗體、戊二醛、牛血清白蛋白（BSA）、吐溫80，均從德國Sigma Aldrich訂購。實驗用水經(jīng)ELGA PURELAB Option純化。

1.2 AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)物的獲得與證明

AFB1-BSA的熒光偶聯(lián)物的獲得。熒光素5（6）-異硫氰酸酯（FITC）為熒光標記物，最大發(fā)射波長519 nm（綠色）。偶聯(lián)方法是，1.5 mg AFB1-BSA加入到1 mL碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液（pH=9.6），F(xiàn)ITC溶于二甲基甲酰胺（1 mg·mL-1），然后，AFB1-BSA與0.24 mL FITC溶液混合在一個避光的玻璃瓶中。在4 ℃下反應過夜后，用Sephadex G25中性柱子（10×220 mm）過濾反應混合物，用Tris緩沖液（pH=8.2）洗脫。使用6900紫外/可見分光光度計測定各組分的吸光度，265 nm（AFB1）、280 nm（蛋白質）和495 nm（FITC），通過熒光分光光度分析（Perkin Elmer LS45熒光分光光度計）證實了所得到的熒光共軛物為AFB1-BSA-FITC。

1.3 APTES包覆MNPs及抗AFB1多克隆抗體的固定化

磁性納米顆粒（MNPs）參照GABROVSKA等人[4]研究的制備方法獲得。利用APTES修飾，使其在MNPs上形成氨基基團[5]。①經(jīng)修飾的MNPs作為多克隆抗-AFB1抗體的固相載體，戊二醛活化納米粒子用于抗體結合，APTES涂層的MNPs（10 mg）懸浮于2 mL 5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液（PB，50 mmol · L-1， pH為8.0），室溫下在搖床上反應2 h，將活化的涂布APTES的MNPs用2 mL 50 mmol·L-1PB洗滌（pH 8.0），再用2 mL 10 mmol·L-1PB（pH 7.4）洗滌5次。 ②完全去除多余的戊二醛后，將多克隆抗-AFB1抗體（327 μg·mL-1）1.6 mL 10 mmol·L-1PB（pH 7.4）加入到納米粒子中。懸浮液在4 ℃下反應過夜。抗-AFB1抗體被固定在活化的APTES涂層MNPs上（MNP-Ab），用10 mmol·L-1pH為7.4的PB進行3次洗滌，加入 2 mL阻斷液（10 mmol·L-1PB，pH為7.4，含5% BSA和0.05% Tween 80），在室溫下?lián)u床上反應1 h；然后對MNP-Ab進行4次洗滌。③將MNP-Ab重新懸浮于10 mmol·L-1PB（pH=7.4）至終濃度為5 mg·mL-1。

檢測固定化抗體活性。在聚苯乙烯微效板上對抗-AFB1抗體進行非特異性吸附，采用Bradford法 （100 μg）測定抗體吸附量。使用和MNP-Ab相同數(shù)量的抗體，3種濃度的AFB1-BSA-FITC熒光共軛物（30 μg·mL-1、50 μg·mL-1和100 μg·mL-1，10 mmol·L-1PB，pH為7.4，含10%甲醇）用于抗體活性測定。

1.4 MNP-Ab用量和熒光共軛濃度的優(yōu)化

優(yōu)化MNP-Ab的用量和AFB1-BSA-FITC的濃度。比較3種不同用量的MNP-Ab：0.125 mg、0.250 mg和0.375 mg，稀釋緩沖液為10 mmol·L-1PB，pH為7.4，含10%甲醇。①幾種不同濃度的200 μL AFB1樣 品（0.25 pg·mL-1、1.00 pg·mL-1、12.50 pg·mL-1、 50.00 pg·mL-1和100.00 pg·mL-1）加入含MNP-Ab小瓶中，在37 ℃搖床中反應15 min。②每個樣品中加入熒光偶聯(lián)物AFB1-BSA-FITC 22 μL（28 μg·mL-1），這些混合物在37 ℃搖床進一步反應15 min。③用磁力分離器收集偶聯(lián)AFB1的MNP-Ab和偶聯(lián)AFB1-BSA-FITC的MNP-Ab。測定上清液中過量的AFB1-BSA-FITC熒光強度，熒光強度與AFB1與MNP-Ab結合呈線性正相關，熒光測量采用熒光分光光度計，得到的熒光數(shù)據(jù)歸一化（NS，%），采用公式（1）計算：

式中：B0為初始AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)物溶液的熒光強度，b為含AFB1樣品的熒光強度，Bx為不含AFB1樣品的熒光強度。

歸一化信號與樣本中AFB1濃度呈線性負相關，NS越高，AFB1濃度越低。

優(yōu)化AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)濃度。試驗偶聯(lián)物濃 度 分 別 為22 μg·mL-1、28 μg·mL-1和35 μg·mL-1， AFB1的使用濃度分別為0.25 pg·mL-1、1.00 pg·mL-1、12.50 pg·mL-1、50.00 pg·mL-1和100.00 pg·mL-1。①在小瓶中加入0.25 mg MNP-Ab。②加入200 μL AFB1溶液，在37 ℃搖床中反應15 min。③加入22 μL的偶聯(lián)物，在相同條件下反應。④使用磁力分離器收集上清液中的過量的AFB1-BSA-FITC，按上述方法測定上清液的熒光強度，并將信號歸一化。

1.5 花生中AFB1的測定

花生用研缽和杵磨成細粉，過篩。將所得的花生粉放入4個容器中（各1 g），3個樣品，1種沒有毒素只有甲醇的樣品。加入溶于甲醇的AFB1使之達到 3個AFB1濃度水平（0.4 ng·g-1、1.0 ng·g-1、2.0 ng·g-1）。 樣品分別在室溫下干燥過夜提取。提取時甲醇/水的比例為80/20（5 mL）。進行下一步含量檢測。①制備4瓶MNP-Ab（0.25 mg）。②加 入200 μL的 花生AFB1稀釋提取物，懸濁液在搖床中37 ℃下反應 15 min。③加 入AFB1-BSA-FITC偶 聯(lián) 物22 μL，濃度為28 μg·mL-1（稀釋緩沖液為含有0.1% BSA的 PB-10%甲醇），在37 ℃的搖床中反應15 min后，按上述方法測定上清液的熒光強度。

2 結果與分析

2.1 AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)物的獲得與證明

競爭性抗原-熒光染料的制備是競爭性免疫熒光分析的主要內容之一。在本研究中，使用商業(yè)上可獲得的AFB1-BSA偶聯(lián)物，可用于直接標記FITC。

所得AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)物經(jīng)紫外可見光譜和熒光分光光度分析可證實。比較AFB1-BSA-FITC、游離的AFB1-BSA和游離的FITC的吸收光譜，該熒光偶聯(lián)物對游離的AFB1-BSA的典型吸收最大值為265 nm和355 nm，對游離的FITC的吸收最大值為495 nm，這3個峰的存在是AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)形成的證據(jù)。在光譜中AFB1（自身熒光）在435 nm的特征發(fā)射峰可以觀察到，在527 nm處還出現(xiàn)了另一個峰，這是FITC在偶聯(lián)物中存在的證據(jù)。因此，AFB1-BSAFITC偶聯(lián)物被成功制備。

2.2 APTES包覆MNPs及抗AFB1多克隆抗體的固定化

通過濕法合成的MNPs中含有羥基作為官能團，固定抗體較為困難，因此修飾MNPs是一個必要的步驟。通過APTES涂層在MNPs表面獲得了氨基，經(jīng)過APTES改性后，顆粒尺寸增大，涂覆后MNPs尺寸為8.2 nm，這種MNPs尺寸對于確保磁體完全分離是非常重要的。

APTES包被的MNPs作為多克隆抗AFB1抗體固定化的固體載體。通過戊二醛結合劑將APTES包覆的MNP表面上的氨基與抗體氨基偶聯(lián)，偶聯(lián)后進行Bradford檢測，結果表明，每1 mg MNPs固定有40 μg抗-AFB1抗體。測定了固定在MNPs的抗體的活性，并與吸附在微孔板上的游離抗體的活性進行了比較，比較結果表明，兩種抗體的活性非常相似，相對活性為92%，結果表明，固定在MNPs上的抗AFB1抗體活性不受化學結合劑的影響。

2.3 MNP-Ab用量的優(yōu)化

MNP-Ab含量和熒光偶聯(lián)物濃度的優(yōu)化是建立單一免疫分析法的重要步驟。不同濃度的MNP-Ab分別在AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)物（28 μg·mL-1）和5種不同濃度的目標抗原（AFB1）下使用。圖1顯示了從5種 不 同 濃 度 的AFB1（0.25 pg·mL-1、1.00 pg·mL-1、 12.50 pg·mL-1、50.00 pg·mL-1和100.00 pg·mL-1） 和 3種不同數(shù)量的MNP-Ab中獲得的歸一化信號，歸一化信號與樣品中的AFB1濃度呈線性負相關。

圖1 MNP-Ab的用量優(yōu)化圖

結果表明，MNP-Ab的最佳用量為0.250 mg。這種情況下，上清液中游離的偶聯(lián)物熒光強度足夠高，不同AFB1添加濃度下上清液中熒光強度的變化也是最大的。顯然，此濃度抗體提供的免疫分析分辨率較好。

2.4 熒光共軛物的優(yōu)化濃度

對熒光共軛物的濃度進行優(yōu)化，結果如圖2所示。主要目標在不同的抗原濃度下獲得足夠強的熒光信號和良好的分辨率。在不同AFB1濃度下（0.25 pg·mL-1、 1.00 pg·mL-1、12.50 pg·mL-1、50.00 pg·mL-1和 100.00 pg·mL-1），AFB1-BSA-FITC偶聯(lián)熒光信號變化最大時，濃度為28 μg·mL-1，信號歸一化后可得到證實。因此，此共軛濃度被選擇為最佳，以確保提高免疫分析分辨率。

圖2 優(yōu)化的AFB1-BSA-FITC濃度隨AFB1濃度變化圖

2.5 花生中AFB1的測定

花生中加入溶于甲醇的AFB1以達到3種不同濃度（0.4 ng·g-1、1.0 ng·g-1、2.0 ng·g-1），同 時 選 一 個不含毒素只有甲醇的花生樣本，樣品干燥后，進行提取程序，提取后稀釋提取液，計算相對標準偏差（RSD）和回收率，見表1，花生中AFB1濃度越低，其結果RSD越低，可接受的回收率為96%～120%。樣品體積為40 μL，不提取情況下，檢測時間不超過 35 min，同時獲得的LOD足夠低（0.9 pg·mL-1），因此，建立的免疫分析法可用于實際樣品中AFB1的檢測。所開發(fā)的檢測方法能夠在沒有非特異性干擾的情況下測定低濃度的毒素。

表1 添加花生樣品中AFB1的檢測結果及回收率表（n=3）

3 結論

建立了一種快速、靈敏的基于MNP的競爭性免疫熒光檢測方法檢測AFB1，檢測線性范圍為2～100 pg·mL-1， AFB1免疫檢測的LOD較低，為0.9 pg·mL-1。獲得的免疫測定時間小于35 min。在這種體系中，分析物到固定抗體的傳質距離大大縮短，因此，與抗體固定在平面表面（如酶標板孔）相比，可更快實現(xiàn)抗體-抗原結合平衡。所得結果證實了所開發(fā)的基于磁性納米顆粒的免疫熒光法在實際樣品中測定AFB1的優(yōu)勢。