微生物法測定嬰幼兒乳粉中葉酸含量方法優化

◎ 張曉金，楊丹妮，鄒雨虹，鮑晗鋒

(常州市食品藥品纖維質量監督檢驗中心，江蘇 常州 213000)

葉酸是一種水溶性維生素，分子式是C19H19N7O6，它廣泛存在于肉類、鮮果、蔬菜中，因綠葉中含量十分豐富而得名[1]。在自然界中有幾種存在形式，其母體化合物是由喋啶、對氨基苯甲酸和谷氨酸3種成分結合而成[2]。葉酸作為人體必需的維生素之一，對于蛋白質的代謝、生理機能的維持起到重要的作用。我國建議成年人每日葉酸攝入量為200 μg，孕婦每日葉酸攝入量為400 μg。妊娠期的婦女服用葉酸不但能夠有效促進胎兒身體器官的發育，而且對于降低胎兒神經管畸形發生率、改善貧血、預防早產[3]等都具有重要作用。研究表明，維持體內較好的葉酸水平，對降低抑郁癥、腦卒中和腫瘤等疾病的發病概率具有積極作用。因此食品中葉酸含量的準確測定十分關鍵，對居民日常飲食、預防疾病具有重要意義。

目前對葉酸的定量檢測方法有很多，如高效液相色譜法[4]、液質聯用法[5]、酶聯免疫法[6]等。但是微生物方法因其穩定性好、靈敏度高等優點成為葉酸檢測的首選方法[7-9]。本研究通過對《食品安全國家標準 食品中葉酸的測定》（GB 5009.211—2014）[10]進行方法和細節優化，理順整個實驗的操作過程，改善標準中的接種液的制備、培養基的配制、樣品的培養時間等關鍵控制點，為需要運用國標方法進行葉酸含量檢測的工作者提供理論和操作的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌菌種：廣東省微生物菌種保藏中心；葉酸標準品（純度≥97%）：北京科量技術有限公司；葉酸測定用培養基、乳酸桿菌肉湯培養基、菌株儲備用瓊脂培養基：北京陸橋技術股份有限公司；氫氧化鈉、乙醇、氯化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SQ510C立式壓力蒸汽滅菌鍋：重慶雅馬拓科技有限公司；MPR-710醫用冷藏箱：松下冷鏈大連有限公司；UV-2600紫外-可見分光光度儀：島津儀器蘇州有限公司；3-18R臺式高速冷凍離心機：上海托莫斯科學儀器；BHC-1300IIB2生物安全柜：蘇潔醫療器械蘇州有限公司；SB25-12DTD超聲波振蕩器：寧波新芝生物科技股份有限公司；BD115恒溫培養箱：德國賓德公司；Lab dancer渦旋混勻器：艾卡廣州儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 玻璃器皿的清洗

將實驗所需玻璃器皿洗刷干凈，沸水浴30 min，瀝干后放入鹽酸浸泡液中浸泡2 h，蒸餾水清洗，經170 ℃度烘干3 h后備用。

1.3.2 菌種的制備

將鼠李糖乳桿菌轉種于菌株儲備用瓊脂培養基，36 ℃培養20 h。連續傳種3代后接種于乳酸桿菌肉湯培養基中，于36 ℃培養20 h后的菌懸液接種于磁珠保藏管內，-70 ℃作為工作菌株保存。臨實驗前一天將磁珠保存的鼠李糖乳桿菌接入乳酸桿菌肉湯培養基中，36 ℃培養20 h進行活化。活化后放入冷藏冰箱備用，用于接種液的制備。

1.3.3 葉酸標準儲備液的制備

精確稱取20.6 mg葉酸標準品，用氫氧化鈉乙醇溶液（0.01 mol·L-1）溶解并轉入1 000 mL容量瓶中，定容至刻度。

1.3.4 葉酸標準儲備液的標定

吸取20 mL標準儲備液至100 mL容量瓶，用氫氧化鈉溶液（1 mol·L-1）定容至刻度。吸取20 mL氫氧化鈉乙醇溶液于100 mL容量瓶中，用氫氧化鈉溶液定容至刻度作為調零管。用1 cm比色杯在256 nm下，測3次吸光度，取平均值計算，見表1。標定好的葉酸標準儲備液置于棕色瓶中。

表1 葉酸標準儲備液濃度標定表

1.3.5 葉酸標準中間液的制備

準確吸取5 mL葉酸標準儲備液于500 mL棕色容量瓶，用氫氧化鈉乙醇溶液稀釋定容。

1.3.6 培養基的制備

按產品要求配制實驗所需用量的葉酸測定用培養液，加熱煮沸至完全溶解，待培養液冷卻后過濾，放入冰箱待用。

1.3.7 葉酸標準工作液的制備

吸取1 mL葉酸標準中間液于1 000 mL容量瓶，用水定容至刻度（現配現用）。

1.3.8 種子培養液的制備

取4 mL葉酸標準工作液和8 mL葉酸測定用培養液混勻，分裝至2支10 mL離心管中，并分別標注為A管和B管（A管為實驗管，B管為備用管）。另取1支僅含5 mL葉酸測定用培養液的離心管標注為C管。將A、B、C管于121 ℃滅菌5 min。將活化的菌株用接種環轉接于冷卻后的A管和B管中，36 ℃培養20 h，培養后的A管和B管離心棄去上層液體，再用0.85%無菌生理鹽水重復清洗3次。在無菌操作下吸取0.5 mL A管菌懸液轉種于僅含5 mL葉酸測定用培養液的C管，36 ℃培養6 h，即為接種液。

1.3.9 樣品的制備

準確稱取0.1～0.5 g，精確至0.001 g樣品于100 mL 錐形瓶中，另取100 mL錐形瓶做空白。加入80 mL氫氧化鈉乙醇溶液，具塞，超聲4 h，轉入100 mL容量瓶中用水定容至刻度，過濾。根據試樣中葉酸的含量，用水對提取液進行稀釋，使得稀釋后的葉酸含量在0.2～0.6 ng·mL-1的范圍內。

1.3.10 標準系列管的制備

取系列管S1～S10分別加入葉酸標準工作液、實驗室用水和葉酸測定用培養基，見表2。為保證曲線的線性關系，需配置3套系列管。

表2 標準系列管的制備表

1.3.11 樣品系列管的制備

取3支試管分別加入樣液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL，然后加入實驗室用水和葉酸測定用培養液，混勻，見表3。

表3 樣品系列管的制備表

1.3.12 滅菌及接種培養

將所有標準系列管和試樣管塞好對應的塞子，于121 ℃高壓滅菌5 min，滅菌完成后為防止培養液顏色加深，應立即將系列管放入冷藏冰箱冷卻降溫。冷卻完成后，在無菌條件下向除0對照管外的系列管中各加入50 μL的接種液[11]，塞好對應塞子，渦旋混勻，于36 ℃培養30 h。

1.3.13 標準系列管和樣品的測定

將培養好的標準系列管和試樣管用1 cm厚的比色皿，于540 nm處，將0對照管調節吸光度為0，測定系列管和試樣管并記錄對應的吸光度值。在每支需測定反應管的吸光度值前用渦旋器混勻10 s，混勻后立即倒入1 cm比色皿中，放入卡槽，5 s后讀數并記錄相應的吸光度值。因菌懸液的沉淀，所以需要相同時間上機讀數，以確保系列管的線性和試樣測定結果的準確性。

2 結果與分析

2.1 培養液制備的優化

國家標準中未對葉酸測定用培養液的制備有詳細的表述，通過實驗發現煮沸溶解而未經過濾的培養液會有少許的沉淀現象出現，而這些沉淀容易造成標準曲線基線不穩定的情況。因此經過煮沸且過濾的培養液，可以有效保證標準曲線的線性關系。

2.2 菌懸液接種量和培養時間的優化

國家標準中菌懸液的接種量為20 μL，培養時間為20～40 h。由于微生物生長的特異性，接種量過少，培養時間過長，容易導致葉酸含量少的基點讀數偏高；接種量少，培養時間過短，容易導致葉酸含量多的基點讀數偏低。經過多次實驗對比發現接種量為50 μL，培養時間30 h最為適宜，其標準曲線相對比較穩定。

2.3 滅菌時間的優化

國家標準中對培養液、系列管和試樣管的滅菌要求都是121 ℃、15 min。但經過實驗發現，過長的滅菌時間會導致培養液的自身顏色加深，從而影響整體的準確性。而121 ℃、5 min也能達到有效的滅菌效果，其顏色對標準曲線的影響也能降到最低。

2.4 葉酸標準曲線繪制

以標準系列管中葉酸含量為橫坐標，以3套標準管每個標準點吸光度值的平均值為縱坐標，繪制標準曲線為Y=-0.564 7X2+1.491X+0.237 4，其中標準曲線相關系數r2=0.997 6，見圖1。由于微生物生長分為：遲緩期、對數期、穩定期、衰亡期4個時期[12]，所以標準曲線需要應用多變量方程來計算。

圖1 嬰幼兒乳粉中葉酸含量標準曲線圖

2.5 重復性實驗

用以上方法對同批次的嬰幼兒乳粉中的葉酸進行取樣測定6次，實驗結果較為滿意，見表4。

表4 重復性實驗表

2.6 回收率實驗

稱取已測試的嬰幼兒乳粉樣品6份，分別加入葉酸標準儲備液0.5 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.0 mL、 2.0 mL和2.0 mL。經實驗測定其回收率分別為92.3%、 91.6%、94.2%、95.1%、102.8%和99.3%，平均回收率為95.9%，從而可以看出此優化方法可以滿足檢測需求。

3 結論

本研究方法在培養基配制時，通過對培養基加熱煮沸后增加過濾的步驟，以此來減少培養基中雜質對標準曲線的影響；在滅菌時相對于國標中的滅菌時間15 min，此方法優化成5 min，以此來減少培養基因長時間的高溫加熱而引起顏色加深對標準曲線的影響；對于國標中的20～40 h的培養時間，通過對接種量和培養時間的多次對比情況，培養時間優化為30 h左右的標準曲線相關線性較為滿意。微生物法測定乳粉中葉酸的含量，其因受到人員、設備、實驗環境、實驗方法等多方面的影響，所以對實驗室和實驗人員的素質都有較高的要求。而經過優化的方法，通過對各檢驗步驟的詳細整理和闡述，能夠為初次運用微生物法進行葉酸檢測檢驗人員提供可靠的理論和操 作參考。