營養鹽磷濃度對斜生柵藻生長的影響

陳曉江，董芙羽，劉曉峰

（1.忻州師范學院生物系，山西 忻州 034000；2.山西臭冷杉省級自然保護區，山西 忻州 034000）

隨著工業化和農業的現代化，生活污水和工農業廢水排入水環境中的量日益增多，導致水體中氮、磷等營養物質也隨排放量不斷增加，造成了水體富營養化［1，2］。富營養化水體充足的氮磷營養鹽促使藻類暴發式增殖，發生水華現象，水質降低［3］。水華形成的機理是水生態修復研究的熱點問題，而通過對外源氮磷污染物總量的控制及運用脫氮除磷技術減少內源污染來治理水體富營養化，以防治水華危害，是水生態修復的主要措施。

目前，對于水華形成機理較好的解釋是N/P（氮磷比）學說［3］。Schindler［4］通過控制加拿大安大略實驗湖區營養鹽試驗，研究不同氮磷比（N/P）對藻類生長的影響，得出低N/P能促進魚腥藻和束絲藻暴發生長。Smith［5］研究了17個湖泊水體的資料提出了通過改變湖泊N/P來減少藍藻水華的發生，提出營養物質中磷為藻類增殖的關鍵因子，在不同的氮磷比條件下，不同藻類繁殖速率具有差異性。在水體中，由于N或P的濃度都會導致N/P的變化，所以藻類暴發式生長究竟是N/P還是N、P濃度的作用還需要深入研究。有研究報道對藻類暴發式生長的水華現象是由于水體中P濃度升高引起的，在易暴發水華的富營養化水體中，浮游植物有充足的營養鹽支持，而P營養鹽由于易形成磷酸鹽沉積，所以在水體中，P營養鹽濃度降低趨勢顯著［6］。在劉俊鵬等［7］對地表水體藻類生長增殖的情況研究中，分析得知總磷是限制該地表水體藻類生長的關鍵因子，且當營養鹽磷濃度為0.1 mg/L時會形成輕度硅藻水華，而營養鹽磷濃度為0.3 mg/L時會形成重度硅藻水華。王俊等［8］研究說明了磷對杜氏鹽藻生長的影響，試驗中增加氮和磷都可以促進其繁殖，隨著磷濃度含量增加，藻類生長速度提高。唐匯娟［9］綜合分析了國內35個湖泊的相關數據，發現在發生水華現象的23個湖泊中，水體中N/P變化為13～35，在沒有發生水華現象的12個湖泊中，水體中N/P則小于13。因此有研究者提出水華現象是由于P濃度上升的結果，與N/P的下降無關。以斜生柵藻（Scenedesmusobliquus）為研究對象，通過測定藻類密度值以分析斜生柵藻的生長曲線，并研究適合其生長的磷濃度范圍。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗藻種為斜生柵藻。

試驗所用試劑有1.74 g/L硝酸鈉、磷酸二氫鈉、3 g/L檸檬酸、3 g/L檸檬酸鐵胺、0.5 g/L乙二酸四乙酸二鈉、1.5 g/L硫酸鎂、1.9 g/L氯化鈣、20 g/L碳酸鈉、2.86 g/L硼酸、1.86 g/L氯化錳、0.22 g/L硫酸鋅、0.08 g/L硫酸銅、0.021 g/L鉬酸鈉。

1.2 方法

采用BG-11培養液為基礎培養液，以磷酸二氫鈉為添加磷源，通過改變磷酸二氫鈉的用量控制培養液中營養鹽磷濃度，設置5組不同磷濃度梯度，分別為A1（0.01 mg/L）、A2（0.05 mg/L）、A3（0.1 mg/L）、A4（0.15 mg/L）和A5（0.20 mg/L），如表1所示，并以不添加磷酸二氫鈉的培養液為對照組（CK）。配制BG-11培養液需先配制5個Stock，Stock1為分別稱取0.3 g檸檬酸、0.3 g檸檬酸鐵胺及0.05 g乙二酸四乙酸二鈉，用去離子水定容至100 mL；Stock2為分別稱取1.74 g硝酸鈉、1.5 g硫酸鎂，用去離子水定容至1 000 mL；Stock3為稱取0.19 g氯化鈣溶于去離子水，定容至100 mL；Stock4為稱取2 g碳酸鈉溶于去離子水中，定容至100 mL；Stock5為分別稱取2.86 g硼酸、1.86 g氯化錳、0.22 g硫酸鋅、0.021 g鉬酸鈉以及0.08 g硫酸銅，并用去離子水將其定容至1 000 mL［10］。

表1 6種不同磷濃度的培養液

分 別 量 取2 mL Stock1、20 mL Stock2、2 mL Stock3、1 mL Stock4和1 mL Stock5，用去離子水定容至1 000 mL，將配制好的6種不同磷濃度的培養液分別量取300 mL備用。

1.3 培養條件

準備18個已經清洗、烘干及滅菌過的250 mL錐形瓶，分為3組，即每個濃度設置3次重復，將配制好的不同磷濃度的培養液分別倒入其中，每個錐形瓶平均倒入150 mL，并加入1 mL藻液。充分搖勻后，用封口膜封住錐形瓶瓶口，放入智能培養箱中進行培養。環境條件設置為光暗比為12 h∶12 h，光照為80%，溫度為28℃，濕度為60%，培養時間為7 d，培養期間每日早、中、晚各選取固定時間進行人工搖瓶3次，并隨機調換錐形瓶位置。

1.4 藻的計數

分別從0、0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L這6個不同磷濃度梯度下取樣，利用血細胞計數板在顯微鏡下觀察，3個重復組均要進行統計計數。取樣時間為每天16：00，測量取樣時，首先搖勻每瓶樣液，然后利用移液槍吸取0.1 mL藻液，讓藻液滲入血細胞計數板的計數室，在顯微鏡下觀察斜生柵藻的形態，記錄藻密度及藻細胞形態的變化，設置3次重復。

1.5 數據處理

藻密度計算公式［11］：

式中，D為藻密度；N為計數板5個中方格的細胞總數；N/5×25為中央大方格細胞總數；n為稀釋倍數。

式中，X2為培養某一時間末的藻類密度；X1為培養某一時間開始的藻類密度；（t2-t1）為某一時間段。

數據記錄采用Excel 2013軟件；數據統計分析利用SPSS17.0軟件。

2 結果與分析

2.1 不同磷濃度對斜生柵藻生長的影響

試驗組藻密度隨培養天數的變化結果如表2所示，隨著培養天數的增加，各組藻密度呈增長趨勢。在培養1 d后，在磷濃度0.15 mg/L條件下藻密度最高，達30.72×104個細胞/mL，對照組藻密度最低，為11.78×104個細胞/mL；在試驗培養2 d、磷濃度0.20mg/L條件下藻密度最大，為36.68×104個細胞/mL，在磷濃度0.05 mg/L條件下藻密度最小，為8.65×104個細胞/mL；在培養3 d、磷濃度0.15 mg/L條件下藻密度最大，為35.78×104個細胞/mL，在磷濃度0.05 mg/L條件下藻密度最小，為20.68×104個細胞/mL；在培養4 d、磷濃度0.20 mg/L條件下藻密度最大，為42.60×104個細胞/mL，在磷濃度0.01 mg/L條件下藻密度最小，為16.58×104個細胞/mL，比培養3 d后的藻密度減少了37.74%；在培養5 d、磷濃度0.10 mg/L條件下藻密度最大，為85.03×104個細胞/mL，在磷濃度0.20 mg/L條件下藻密度最小，為44.25×104個細胞/mL；在培養6 d、磷濃度0.15 mg/L條件下藻密度最大，為107.8×104個細胞/mL，對照組藻密度最小，為70.72×104個細胞/mL；在培養7 d、磷濃度0.20 mg/L條件下藻密度最大，為129.38×104個細胞/mL，對照組藻密度最小，為105.42×104個細胞/mL。

表2 不同磷濃度下斜生柵藻的密度 （單位：104個細胞/mL）

2.2 不同磷水平下斜生柵藻比生長速率

由圖1可見，在培養周期內對照組比生長速率最大，為0.44，在磷濃度0.01 mg/L條件下比生長速率次之，為0.38，其中，在磷濃度0.20 mg/L條件下比生長速率最低，為0.26。分析可知，在培養初期，磷濃度對藻類生長有明顯的影響，隨著培養時間的增加，磷濃度對藻類生長的影響明顯降低，在磷濃度為0.15 mg/L時，藻類生長較好，表明藻類生長較適宜的磷濃度為0.15 mg/L。

圖1 培養周期內對照組（CK）與試驗組（A1、A2、A3、A4和A5）比生長速率比較

由圖2可以看出，在藻類培養周期內，試驗組相對于對照組每天藻類生長速率波動較大，說明藻類生長受多種條件影響，其生長過程呈非線性。在磷濃度0.20 mg/L條件下藻類比生長速率波動幅度最大，說明在磷濃度較高的條件下，藻類出現暴發式生長。培養5～6 d，除磷濃度0.20 mg/L外，其他各濃度比生長速率均上升，在培養6～7 d、磷濃度0.15 mg/L條件下的比生長速率高于其他濃度，說明磷濃度0.15 mg/L較適宜于藻類生長。

圖2 試驗組相對于對照組的斜生柵藻比生長速率的變化

2.3 單因素方差分析

為了深入分析磷濃度對藻類生長的影響，對試驗組數據進行單因素方差分析，從表3可以看出，組間離差平方和所占比例較小，僅為1.5%，組內離差平方和所占比例較大，為98.5%，據此，說明磷濃度梯度在培養周期內對藻類密度影響不顯著，藻類密度受其他相關因子影響較大。

表3 單因素方差分析

從單因素方差分析均值（圖3）可以看出，在磷濃度0.15 mg/L條件下，培養周期內藻類密度均值最大，對照組中藻類密度均值最小，磷濃度的增加對藻類生長有促進作用，當磷濃度增加值達0.15 mg/L時，藻類生長密度達到最大，繼續提高磷濃度到0.20 mg/L時，藻類生長密度下降，說明磷濃度達0.15 mg/L對藻類生長較為充足，繼續提高營養鹽磷濃度，藻類生長受到限制。

圖3 不同磷濃度梯度下藻類密度均值分析

3 小結與討論

一般情況下，藻類生長受氮磷比影響，根據研究資料得知，N/P為16∶1稱作Redfield比率，在諸多研究中，Redfield比率作為區分藻類生長的營養鹽限制類型［13-15］。斜生柵藻是一種在水中對污染物有一定耐受性的單細胞綠藻，常用于檢測水環境質量的指示物種［16-18］，本試驗選斜生柵藻為試驗培養對象，在不同磷濃度梯度條件下培養藻類，結果表明，在營養鹽氮充足的條件下，磷濃度對藻類生長初期有促進作用，斜生柵藻在磷濃度0.15 mg/L條件下藻密度最大，磷濃度提高到大于0.15 mg/L時，藻類生長受到限制。陳永川等［19］在研究滇池藻類生長情況與環境因子關系時，通過測量滇池不同區域水體和不同層次水體葉綠素a動態，得出水體葉綠素a的含量年變化與滇池水體總磷呈顯著正相關，水體中藻類的生長與總磷及可溶性磷在空間變化上呈顯著正相關。本試驗結果顯示，水體中的磷濃度對斜生柵藻的生長有促進作用。侯秀麗等［20］在研究滇池氮磷營養鹽對水體浮游植物結構變化影響中，通過滇池10個監測樣點藻類變化與氮磷變化的關系，得出水體中綠藻更加適合較高的氮磷比環境，藻類生長與水體總磷呈顯著正相關。在本次試驗培養初期，斜生柵藻的形態多由2個藻細胞組成，但隨著培養天數的增加，較多地出現4個藻細胞和8個藻細胞的形態，藻密度增加。培養期到5 d時，各試驗組的藻密度均明顯增加，但是在磷濃度0.20 mg/L條件下，藻密度減小，許海等［21］研究結果顯示斜生柵藻在磷濃度達0.20 mg/L時，斜生柵藻達到最大生長速率，提出藻類生長同時受到水體中氮磷比環境條件的影響。蔣鑫艷等［22］在研究烏梁素海葉綠素a時空分布與環境因子關系時，得出總磷是影響烏梁素海葉綠素a的主要水化學因子，總磷與藻類生物量呈顯著性正相關。

在營養鹽磷濃度水平較低條件下，斜生柵藻生長受到營養鹽的限制影響，結果表明，在磷濃度0.15 mg/L條件下斜生柵藻密度達最大值，為129.25×104個細胞/mL。根據試驗組相對于對照組的比生長速率數據分析，藻類生長受多種條件影響，其生長過程呈非線性。在磷濃度0.20 mg/L條件下，斜生柵藻培養初期相對于對照組比生長速率最高，表明在較高磷濃度條件下，藻類會出現暴發式增殖，說明水體中較高的磷濃度是水華暴發的原因之一。