酵母菌發酵豆粕產物培養水產用小球藻的研究

武 順，駱淑媛，江 陽，金衛華

（武漢東湖學院生命科學與化學學院，武漢 430212）

小球藻是一種單細胞藻類，分布廣泛，可利用光合作用自養或異養生活，因其營養價值高，富含蛋白質、維生素、礦物質等，且食品安全性較好，具有很好的開發應用前景，特別是在食品和飼料添加劑方面［1-3］。隨著水產養殖業的興起，小球藻越來越受到重視。研究表明，用小球藻喂食的魚、蝦等，其生長發育能得到顯著改善［4］。由于小球藻的開發利用存在諸多難題（如規模化快速有效地培養等），導致小球藻在國內尚未產業化。有關小球藻的培養研究主要集中在利用無機鹽培養方式［5-8］，或無機鹽與有機試劑混合培養［9］，其次是使用沼液、廢水和家畜糞便發酵物作為原料進行培養［10-12］。而作為飼料的小球藻，利用以上方式培養是存在問題的，無機鹽培養基中含有較多的重金屬離子，如常用的BG11培養液中含Cu、Mo、Co、Mn等，雖然對小球藻的生長具有促進作用，但對動物是有一定毒性的，引起動物生長發育異常甚至死亡，沼液、廢水和糞便發酵物雖然有很多成分可供應小球藻生長，但難免有很多有害微生物滋生，在水產方面還會引起氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等的累積，嚴重影響水產品品質。在小球藻培養方面，如何做到廉價、快速、易操作和無污染，是目前面臨的問題之一。酵母菌可以直接作為飼料或用于發酵飼料已有廣泛的研究和應用［13］。因此，選用廉價、營養豐富的豆粕，采用酵母發酵的方式，生產的發酵液直接用于小球藻培養，除了可用作水產養殖的餌料和動物的飼料添加劑，也可作為人類的綠色食品。

1 材料與方法

1.1 材料

豆粕市售；安琪福邦釀酒酵母Ⅰ型（飼料級水產專用）；蛋白核小球藻由武漢東湖學院實驗室分離純化。

1.2 試劑

CaCl2·2H2O、NaNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、Na2CO3、H3BO4、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、EDTA、CuSO4·5H2O、Na2MoO4·2H2O、Co（NO3）2·6H2O、葡萄糖（以上化學試劑均為化學純，國藥集團化學試劑有限公司），COD/總磷/總氮/氨氮水質測試包（日本共立理化學），亞硝酸鹽/硫化物檢測試劑盒（杭州陸恒生物科技有限公司）。

1.3 儀器

AUY120型分析天平（日本島津公司）；i3型紫外可見分光光度計（濟南海能儀器股份有限公司）、3K18型臺式冷凍離心機（美國Sigma公司）；DELTA 320pH計（瑞士梅特勒-托利多公司）；HQY-C-J型搖床（金壇市鴻科儀器廠）；SPX-300B-G光照恒溫培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療期器械有限公司）；CX31型普通顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.4 方法

1.4.1 酵母菌的活化與豆粕發酵接種 使用液體土豆培養基31℃振蕩培養活化酵母菌，離心收集菌體，菌體用無菌水清洗兩次后制成同體積菌懸液（A600=0.158），用于豆粕發酵；取10 g豆粕倒入500mL錐形瓶中，加入150 mL水，混合均勻后121℃蒸汽滅菌20 min，冷卻后無菌接種酵母菌懸液5 mL（2.5%的接種量），分別放在28、29、30℃搖床中恒溫振蕩發酵，轉速為120 r/min，發酵72 h。

1.4.2 不同溫度和不同培養液對小球藻生長的影響 將發酵72 h的豆粕發酵液過濾后，將濾液6 000 r/min離心10 min，取上清液，一份直接用于小球藻培養，另一份煮沸5 min除去其中大部分活菌體后即為培養小球藻用的發酵液，按表1加樣后分別在25℃恒溫靜置培養，光照度為1 000 lx，每24 h搖瓶懸浮小球藻1次，并測定A680，連續測定9 d。

表1 小球藻培養前培養液加入量

1.4.3 不同豆粕發酵時間對小球藻生長的影響 將豆粕在28℃的發酵時間延長至3、5、7、9 d，取不同發酵時間的發酵液，按表1中1號瓶加樣并培養小球藻，測連續6 d的A680，每組做3個平行試驗，取平均值。

1.4.4 總氮、氨氮、亞硝酸鹽、總磷、硫化物、COD、溶氧量測定 按表1中1號瓶加樣培養，測連續9 d總氮含量和連續7 d亞硝酸鹽、氨氮濃度，以表1中3號瓶加樣培養為對照；總磷、硫化物、COD、溶氧量均按表1中1號瓶加樣培養測定7 d后參數，測量方法均按相應試劑盒說明書進行。

1.4.5 豆粕發酵后消耗率的測定 在28℃接種發酵，分為4組，每組發酵時間分別為3、5、7、9 d，發酵完成后離心棄上清液，烘干殘渣至恒重后準確稱量，每組做3個平行試驗，取平均值。豆粕消耗率=發酵后固體物質質量/發酵前豆粕質量×100%。

1.5 數據處理

數據采用SPSS 17.0軟件的One-way ANOVA進行統計學分析，計算結果以“平均值±標準誤”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同發酵溫度下產生的培養液經初步滅菌后對小球藻生長促進作用

從圖1至圖3可以看出，29℃的發酵液單獨使用與結合BG11培養液，與單獨使用BG11培養液相比，對小球藻的生長具有顯著促進作用（P＜0.05），兩種培養液同時使用時，9 d后小球藻仍有生長趨勢；其次是使用28℃的發酵液單獨培養，小球藻前期生長速率遠遠高于添加了BG11培養液（P＜0.05），后期生長比較穩定，7 d即達到生物累積量最大。與單獨用BG11培養液培養小球藻相比，3個不同溫度下的發酵液均表現出顯著的促進作用。

圖1 溫度為28℃的發酵液培養的小球藻生長趨勢

圖2 溫度為29℃的發酵液培養的小球藻生長趨勢

圖3 溫度為30℃的發酵液培養的小球藻生長趨勢

2.2 發酵液未滅菌和初步滅菌后對小球藻生長的促進作用比較

從圖4可以看出，發酵液經過除菌比不除菌效果好很多，培養前5 d，兩者效果無明顯差異，但后4 d差異顯著（P＜0.05）。

圖4 溫度為28℃的發酵液未滅菌和煮沸滅菌后培養的小球藻生長趨勢

2.3 28℃時不同發酵時間下產生的培養液對小球藻生長促進作用

從圖5可以看出，豆粕經發酵7 d后所得產物最有利于小球藻生長，培養的小球藻在第6天仍保持良好的生長狀態，發酵后3、5、9 d的代謝產物對小球藻生長促進效果區別不大，在第5天后生長基本處于停止狀態。

圖5 不同發酵時間產生的培養液培養的小球藻生長趨勢

2.4 小球藻生長過程中培養液的總氮、氨氮和亞硝酸鹽濃度變化

由圖6至圖8可以看出，隨著培養時間延長，發酵液中的總氮、氨氮和亞硝酸鹽逐漸消耗完，雖然BG11中氨氮也可耗盡，但總氮和亞硝酸鹽卻有較高水平的殘留。

圖6 不同培養液培養小球藻時總氮濃度變化

圖8 不同培養液培養小球藻時亞硝酸鹽濃度變化

2.6 培養小球藻后培養液中與水質參數

由表2可以看出，小球藻培養過程中，能有效增加水中溶氧量，該溶氧量適合各種水產品。培養液中總磷含量偏低，藻類生長一般在有效磷含量為0.2～1.0 mg/L的范圍內比較合適，總磷含量偏低的原因與快速生長繁殖的小球藻對磷的利用有關。硫化物含量略有偏高的原因考慮有3個方面因素：一是培養液中主要營養成分來自于高蛋白水解產生的硫化物；二是培養過程非無菌培養，由雜菌生長代謝產生；三是小球藻培養在較小空間進行，代謝產生的氣體（如硫化氫）難以迅速揮發，在自然水域或養殖池中，硫化物含量應該會有所下降。培養液中酸堿度偏堿性，是適合水生生物生長的；培養液中COD＜15.0 mg/L，符合地表水環境質量標準Ⅰ級。

圖7 不同培養液培養小球藻時氨氮濃度變化

表2 小球藻培養7 d后培養液中影響水質的各項指標

2.7 豆粕發酵后的消耗量

從表3中得出，發酵7 d后的發酵液，豆粕消耗量最大，發酵液中可溶性營養物質的含量最多。

表3 豆粕發酵時間與消耗量

3 討論

3.1 不同溫度、不同時間發酵豆粕的產物不同

在相同培養條件下，與29℃和30℃相比，28℃時的發酵產物明顯利于小球藻的吸收利用（P＞0.05），在相同溫度下，發酵7 d的效果最好，說明酵母菌在發酵豆粕過程中的代謝活動與溫度、發酵時間密切相關。

3.2 豆粕發酵產物比BG11培養液更適合小球藻的培養

在相同培養條件下，培養小球藻9 d，BG11培養液的產率和效率是最低的。豆粕和小球藻同屬植物都能進行光合作用，在細胞的化學組成上應有相似性，通過酵母菌的降解作用，豆粕中部分物資被降解成可溶性小分子或大分子，這些分子可以被小球藻直接利用合成自身物質，省去其中的能量代謝過程，BG11培養液的組成基本為無機鹽分子，要成為小球藻組成成分需一系列復雜的代謝和光合作用。小球藻在發酵液中生長速率遠比BG11培養液中的快，發酵液結合BG11培養液具有更好的生長促進作用，這可能是發酵液中有效成分在9 d后已經消耗殆盡，BG11培養液中存在富余養料的原因。當給予足夠的發酵液時，小球藻也會持續生長，并且不斷沉淀在底部，移除底部的小球藻后，培養液仍然可以繼續培養至無營養狀態。

3.3 豆粕發酵液在用于小球藻培養前應盡量除去其中菌體

發酵液不經煮沸直接培養小球藻，容易導致酵母菌的快速繁殖。同時，小球藻生長緩慢，甚至停止生長的現象，可能是酵母菌的大量繁殖，二次代謝消耗了培養液的大部分營養成分或種群抑制。此外，在試驗中發現，如果采用在低速搖床中培養小球藻時，菌體繁殖更快，小球藻基本不能生長，因此一般采用靜置培養效果比較好。

3.4 發酵液培養小球藻后，其中總氮、氨氮和亞硝酸鹽的殘留

豆粕發酵后，發酵液中有一定量的氨氮和亞硝酸鹽，在不同溫度和不同發酵時間下，發酵液中的氨氮濃度均為0.8 mg/L，亞硝酸鹽濃度為0.005 mg/L，與該酵母菌的代謝特點有關，在BG11培養基配制后，可能是其中含有硝酸鹽的原因，與其他試劑混合后產生了少量氨氮和較高濃度的亞硝酸鹽，兩種培養液在培養小球藻過程中，均出現短暫的氨氮濃度上升過程，經過5 d培養后，氨氮均已消除，發酵液培養液中亞硝酸鹽在培養3 d后可以完全消除，并且在后4 d培養過程中再沒有出現，而BG11培養液中亞硝酸鹽雖然初期濃度降低，但后期培養始終未能消除。以上說明BG11培養液的配比存在一定缺陷，其中有富余的N不能被小球藻利用，小球藻不斷生長、沉淀、再生長。此外，試驗還發現，以發酵液培養小球藻，如果出現培養液中菌體大量繁殖時，氨氮及亞硝酸鹽的濃度將大幅度升高，而小球藻生長受到抑制，將無法由小球藻的代謝來降低氨氮及亞硝酸鹽含量。在比較復雜的環境中，如沼液、畜禽糞便發酵液中含有大量細菌，對小球藻的生長是不利的，可能生長的是其他藻類。

雖然BG11培養液對小球藻生長具有一定促進作用，但其中殘留的亞硝酸鹽和總氮，特別是亞硝酸鹽以及較多的重金屬離子的存在，對水產養殖水體會造成嚴重污染，可以導致水產品的直接死亡，BG11培養液不適合在水產領域直接應用；相反，豆粕發酵液經過小球藻的生長利用后，影響水質的幾個重要參數均已達到Ⅱ類水質水平［14］，在培養小球藻后直接應用，試驗中使用潔凈的自來水，一方面可以補充部分小球藻生長所需的部分金屬離子，如Ca2+、Mg2+等（其他離子均來自天然豆粕中），另一方面，自來水具有一定的殺菌抑菌功能，可以抑制有害菌的滋生，整個發酵培養過程操作簡單，來源豐富而廉價，適合規模化培養小球藻。

3.5 豆粕發酵時間與營養物質累積之間的關系

發酵7 d的培養液消耗豆粕的量最大，與最能有效促進小球藻生長結果是一致的，發酵9 d后的消耗率沒有發酵7 d的高，說明酵母菌在代謝過程中可以重新利用代謝產物進行再次繁殖，由于通過離心的方式將菌體質量包含在豆粕剩余量中，所以發酵液中可溶性物質是減少的，這與發酵9 d的發酵液沒有發酵7 d的發酵液在培養小球藻時效果明顯相符，也與未煮沸除菌的發酵液容易導致菌體大量繁殖相符。

4 小結

豆粕發酵液對小球藻生長具有顯著促進作用；經豆粕發酵液培養后的水體以及小球藻不含影響水質的污染因素；豆粕發酵液培養的小球藻可以直接應用在水產養殖領域。