木質纖維素降解復合菌系篩選與鑒定

孫苗苗，李 娟，劉國慶，周春陽，韋張其，吳建鑫

（1.合肥工業大學食品與生物工程學院，合肥 230601；2.空軍第一后勤訓練基地烹飪教研室，上海 200443）

隨著木質纖維素生物降解機理研究的不斷深入，在生物降解過程中微生物間的協同關系也逐漸受到人們的重視，雖然纖維素的生物降解已研究了很長時間，但為了提高木質纖維素的降解效率，不同領域的研究學者已經進行了大量的科研工作。近年來研究發現，木質纖維素降解需要經過2種或更多種微生物的組合來完成，單一的微生物卻只能發揮微弱作用甚至沒有作用［1］。因此，人們越來越關注微生物混合培養或混合發酵，如Haruta等［2］富集篩選得到一組能夠有效降解稻草的復合菌系，該菌系在4 d時稻草降解率達60%。Wongwilaiwalin等［3］得到一組能夠有效降解工業蔗渣、稻草、工業桉樹紙漿的高溫纖維素降解復合菌群。目前國內也有許多學者致力于木質纖維素降解復合菌系的研究，杜然等［4］構建一個降解纖維素的兼性厭氧復合菌系培養72 h可使濾紙失重90%，且發酵3 d乙醇積累濃度可達1.54 g/L。劉爽［5］構建的復合菌系在216 h內稻草降解率達75%。崔宗均等［6］以4種高溫堆肥為原料構建了一組高效穩定的纖維素分解菌復合系MC1，該復合系8 d可將水稻秸稈完全降解。Wang等［7］通過限制性培養技術獲得了一組50℃靜置條件下培養的木質纖維素快速降解復合菌系，培養3 d內濾紙完全降解。利用類似的方法，Qin等［8］、Zhang等［9］、李維華等［10］也獲得具有木質纖維素降解能力的復合菌系，均表現出較好的降解效果。因此，篩選能夠降解纖維素的高效復合菌，用于木質纖維素降解復合菌株的使用已成為當前研究的熱點［11，12］。

本研究以腐爛的秸稈為主要原料，利用纖維素剛果紅培養基分離純化菌系，通過羧甲基纖維素酶活性的測定、濾紙條的降解試驗、菌株的復篩（濾紙條酶活、CMCase酶活測定）來選出高效微生物群系，構建復合菌系，并進行傳代培養，選出高效微生物群系，之后進行篩選檢測，確定微生物群系的組成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 宣城市宣州區合肥工業大學周邊田地腐爛的玉米秸稈。

1.1.2 試劑

1）DNS試劑。酒石酸鉀鈉18.2 g，溶于50 mL去離子水中，加熱后，依次加入3，5-二硝基水楊酸0.63 g，NaOH 2.1 g，苯酚0.5 g，攪拌至完全溶解，冷卻后用去離子水定容至100 mL，于棕色瓶中7 d室溫保存。

2）pH 4.8檸檬酸緩沖液（0.05 mol/L）。分別稱取10.51 g檸檬酸、14.71 g檸檬酸鈉，各自定容至500 mL，即為0.1 mol/L的檸檬酸和檸檬酸鈉溶液。取檸檬酸溶液和檸檬酸鈉溶液各11.5 mL，混勻后加入去離子水至50 mL，即為0.05 mol/L的pH 4.8檸檬酸緩沖溶液。

3）0.51%CMC-Na溶液。稱取0.51 g CMC，添加適量的0.05 mol/L檸檬酸緩沖溶液，加熱溶解定容至100 mL，用前充分搖勻。

4）葡萄糖標準溶液（1 mg/mL）。稱取1 g葡萄糖，加入去離子水定容至1 L，即為1 mg/mL葡萄糖標準溶液。

1.1.3 培養基

1）纖維素剛果紅培養基。CMC-Na 2.0 g/L，（NH4）2SO42.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO41 g/L，Mg-SO4·7H2O 0.5 g/L，剛果紅0.4 g/L，瓊脂12 g/L，pH 7.0。

2）濾紙條崩解培養基［13］。（NH4）2SO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，酵母膏0.1 g/L，濾紙條（1 cm×6 cm）1條/試管，pH 7.0。

3）羧甲基纖維素鈉培養基。CMC-Na 10 g/L，蛋白胨2 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，酵母膏0.5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0。

4）發酵產酶培養基［14］。玉米秸稈粉20 g，NH4NO34 g，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，無水CaCl20.4 g，NaCl 0.5 g，去離子水1 000 mL，pH 6.0。

5）CMC-Na固體培養基。CMC-Na 15 g，NH4NO31.0 g，酵母膏1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，去離子水1 000 mL，加入瓊脂20 g。

6）PDA培養基。馬鈴薯浸汁（20%）100 mL，瓊脂2 g，葡萄糖2 g，pH 7.0。

7）高氏合成1號培養基。可溶性淀粉2.0 g，KNO30.1 g，K2HPO4·3H2O 0.05 g，FeSO4·7H2O 0.001 g，NaCl 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，pH 7.2～7.4，瓊 脂1.5～2.0 g，去離子水100 mL。

1.1.4 主要儀器 DHG-9145A型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；722型可見光分光光度計752N，上海儀電分析儀器有限公司；PHS-25型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；JW-3021H型高速離心機，賽默飛世爾科技有限公司；THZ-82A型數顯氣浴恒溫振蕩器，常州市金壇科興儀器廠；BM1000型生物顯微鏡，南京江南永新光學有限公司；YXQ-LS-50S11型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司；DHP-9082型電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；FD-15-T-500A型中藥材高速粉碎機，上海市閔行區艦艇工貿有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的處理與初篩

1）樣品處理。準確稱取秸稈樣品10.0 g，加入到盛有90 mL無菌生理鹽水且帶有玻璃珠的250 mL三角瓶中，于37℃恒溫搖床搖動，將樣品充分混勻打散3 h備用。

2）初篩純化。首先，將采集的樣品用無菌水逐級稀釋至10-6、10-7和10-8倍后，分別取0.1 mL涂布于纖維素剛果紅選擇性培養基上，每個濃度重復涂布3個平板，28℃培養，定期觀察，挑取菌落周圍出現清晰透明圈的菌株；然后，通過劃線分離純化所挑取的菌株，直至得到單菌落。

1.2.2 羧甲基纖維素酶活性的測定

1）將純化后的菌株進行篩選，選擇生長狀況較為良好的菌株，初步根據顯微鏡下形態觀察確定菌株的種屬。

2）將霉菌和放線菌制成菌懸液分別涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基和高氏1號培養基上，待霉菌菌落和放線菌菌落長出后，用打孔器取6 mm的菌餅，接種于纖維素剛果紅平板，而細菌則直接采取點接的方式接種于纖維素剛果紅培養基上，在28℃恒溫培養箱中培養3～5 d，觀察并測量透明圈的直徑；酶活高低的判斷則通過透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值進行初步判斷。

重量控制系統基本原理是根據煙支實時重量，對平準盤高度進行調節來控制煙支重量，是一種典型的滯后控制系統。系統采用PID控制算法進行控制。

1.2.3 濾紙條崩解試驗 將篩選出的具有高CMCase活性的菌株進行活化，分別取1 mL接種于裝有20 mL的濾紙條崩解培養基的試管中（每根試管放入2條濾紙條（每條6 cm），培養10～12 d，定期觀察濾紙條崩解情況［15］。

1.2.4 菌株的復篩

1）葡萄糖標準曲線的繪制。取8支潔凈的具塞試管進行編號，并按照表1的要求依次加入溶液，繪制葡萄糖標準曲線。分別取葡萄糖標準液（1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于20 mL試管中，用去離子水將每支試管補加至2.0 mL，將去離子水與標準葡萄糖標準液的混合溶液充分搖勻后，分別準確加入DNS試劑2.0 mL，搖勻后沸水浴5 min，流水冷卻，用去離子水補足至20 mL。在540 nm處測定吸光度，以第1支試管進行調零，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

表1 葡萄糖標準液的配制

2）粗酶液的制備［16］。將通過挑選的菌株制成菌懸液，分別取2 mL菌懸液加入裝有50 mL發酵培養的150 mL三角瓶中。30℃、160 r/min，搖床培養3 d，獲得的培養液8 000 r/min離心15 min，所獲得的上清液即粗酶液。

3）酶活的測定［17］。①濾紙條酶活。取3根20 mL的具塞試管，分別向其中加入0.5 mL的粗酶液、1.5 mL的檸檬酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 4.8），向第1支試管中加入2.0 mL DNS試劑，搖勻并放入50℃水浴鍋中預熱5 min。各加入1條6 cm濾紙條，搖勻，50℃反應60 min，取出后立即在第2、第3試管中加入2.0 mL DNS試劑，搖勻，沸水浴5 min。取出冷卻至室溫，搖勻。以第1支試管為空白，在540 nm處測定吸光度。

②羧甲基纖維素酶活。取3根20 mL的具塞試管，分別向其中加入1.5 mL的0.51%CMC檸檬酸緩沖液，各加入0.5 mL酶液，向第1支試管中加入2.0 mL DNS試劑，搖勻并放入50℃水浴鍋中預熱。50℃反應30 min。取出后除第1支試管外都加入2.0 mL的DNS試劑終止酶反應。之后搖勻并沸水浴5 min，取出冷卻至室溫，搖勻。以第1支試管為空白，在540 nm處測定吸光度。酶活的單位與濾紙條酶活類似。

1.2.5 菌株的鑒定 將挑選出來的菌株首先采用形態觀察鑒定，之后根據它們的DNA序列和ITS序列比對進行鑒定。

1）形態觀察。①采用劃線分離，挑取單菌落劃線于不同的培養基上，讓各菌株在適宜生長溫度下培養（細菌和放線菌28℃培養，真菌在30℃培養），觀察菌落的生長狀況，并做好記錄。②對生長良好的菌株進行鏡檢觀察，觀察其在顯微鏡下的形態特征，并拍照記錄。

2）序列比對鑒定。首先采用細菌基因組提取試劑盒提取細菌和放線菌總DNA，采用真菌基因組提取試劑盒提取真菌總DNA。

①細菌16SrDNA序列擴增。采用338F（5′-AC TCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）與806R（5′-GGAC TACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物擴增細菌菌株16S rDNA序列。PCR反應體系：Phusion?Hot Start Flex 2X Master Mixart Version 12.5μL、Forward Primer 2.5μL、Reverse Primer 2.5μL、模板DNA 50μL、ddH2O 25μL。PCR反應條件：98℃預變性30 s；98℃變性10 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環；最后72℃延伸10 min；4℃保存。將擴增后的DNA進行凝膠電泳檢測，觀察目的條帶是否存在并符合要求。

②真菌ITS2序列擴增。采用fITS7（5′-GTG ARTCATCGAATCTTTG-3′）與ITS4（5′-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3′）引物擴增真菌菌株ITS序列。

PCR反應體系：Phusion?Hot Start Flex 2X Master Mixart Version：12.5μL、Forward Primer 2.5μL、Reverse Primer 2.5μL、模板DNA 50μL、ddH2O 25μL。PCR反應條件：98℃預變性30 s；98℃變性10 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環；最后72℃延伸10 min；4℃保存。將擴增后的DNA進行凝膠電泳檢測，觀察目的條帶是否存在并符合要求。

2 結果與分析

2.1 初篩結果

2.1.1 分離純化結果 通過纖維素剛果紅培養基的涂布培養，選擇出24株生長較好的菌株對其編號，進行分離純化并選擇出幾株菌株的生長情況，如圖1所示。從菌落形態可以初步判斷多數菌為霉菌、放線菌和少量的細菌。

圖1 部分單菌落生長情況

2.1.2 剛果紅初篩結果 將分離純化后生長迅速的菌株分別采取打孔、點接的方式進行剛果紅培養篩選，觀察并測量其透明圈的直徑和菌落直徑。測量結果如表2所示，根據透明圈直徑與菌落直徑的比值大小，選擇出A1、A3、A4、N1、C1、G3、P1這7株菌株進行濾紙條崩解試驗。在這7株菌株中C1、N1這2株菌株的纖維素酶活較為明顯。

表2 菌落直徑與其對應透明圈直徑大小匯總

由圖2可以看出，菌株羧甲基酶活的高低與菌株直徑、透明圈直徑的測量比值結果相一致。

圖2 剛果紅透明圈初篩結果

2.1.3 濾紙條崩解試驗結果 根據濾紙條的降解情況判定符合條件的菌株。從圖3可以看出，多數濾紙條的降解程度不完全，處于濾紙條周邊出現毛邊的情況；部分是3/5發生降解；較少部分發生完全降解。發生降解的只是少部分，可能是只以濾紙條為碳源，其微生物需要的生長碳源供給不足。

圖3 濾紙條崩解試驗結果

2.2 復篩結果

1）葡萄糖標準曲線。所繪制葡萄糖標準曲線（圖4）的R2=0.999 3，說明該標準曲線的擬合程度好，可以用于試驗結果的計算。

圖4 DNS試劑測定葡萄糖標準曲線

2）濾紙酶活與CMCase酶活。根據濾紙酶活與CMCase酶活的測定方法，得到的菌株酶活如表3所示。從表3可以看出，A3、N1、C1這3株菌株的濾紙酶活較大，且其所對應的CMCase酶活也相對較大。可能是因為篩選過程菌株沒有達到最優的結果，以及在粗酶液制備過程的培養時間不夠。

表3 菌株酶活力 （單位：U/mL）

2.3 菌株鑒定結果

2.3.1 形態鑒定結果 將酶活較大的幾株菌株經過CMC培養基劃線分離純化培養后得到不同的菌落，如圖5所示。根據菌落形態可以初步看出，部分菌落表面有菌絲，顏色呈現白色；有的菌落看起來為偏黃色，有酒香味；有的形成質地致密的小菌落，干燥、不透明、難以挑取，菌落表面為粉末狀或顆粒狀。

圖5 單菌落形態鑒定

2.3.2 菌株鏡檢結果 顯微鏡觀察結果如圖6所示。從圖6可以看到，鏡檢下的菌絲交織在一起，呈網狀，假性分支，樹枝狀，無規則發散蔓延生長，有明顯節狀。

圖6 菌株鏡檢結果

2.3.3 分子生物學鑒定

1）將擴增后的DNA進行凝膠電泳檢測，得到的序列電泳如圖7所示，序列1、序列2、序列4為所挑選菌株目的條帶片段。由引物338 F和806 R PCR擴增得到的目的片段長度約為469 bp，為了滿足建庫的需要，需對引物進行修飾，合成帶有測序用接頭的引物，因此，實際電泳得到的片段長度更長。

圖7 細菌菌株16Sr DNA序列電泳結果

2）將擴增后的ITS進行凝膠電泳檢測，得到的序列電泳如圖8所示，序列1、序列3為所挑選菌株目的條帶片段。由PCR擴增得到的目的片段長度約為353 bp，為了滿足建庫的需要，需用帶有測序用接頭的引物，因此，實際電泳得到的片段長度更長。

圖8 真菌ITS序列電泳結果

3）ITS序列的系統發育樹構建。利用MEGA軟件進行ITS序列同源性比對，將菌株的ITS基因序列測得的DNA單鏈堿基序列提交NCBI中進行在線BLAST同源比對后繪制菌種發育樹（圖9）。該菌株鑒定后結果顯示為栓菌（Trametes）、被孢霉（Mortierella）、稻瘟病菌（Sarocladium）、未分類的真菌（Fungiunclassified），其中，與稻瘟病菌的同源性較高，為83%。

圖9 ITS序列的系統發育樹構建

4）16S rDNA序列的系統發育樹構建。利用MEGA軟件進行ITS序列同源性比對，并采用N-J法構建系統發育樹，將該菌株的16SrDNA基因序列與NCBI現有數據庫進行BLAST序列比對，如圖10所示。該菌株鑒定后結果顯示為未分類的鏈霉菌（Streptomycetaceaeunclassified）、未分類的放線菌（Actinomycetalesunclassified）、丙酸桿菌（Propionibacterium）、鏈霉菌（Streptomyces）、未分類的細菌（Bacteriaunclassified）。其中，與鏈霉菌的同源性為87%。

圖10 16Sr DNA序列的系統發育樹構建

3 小結

本次試驗僅研究了構建高效復合菌的方法，并通過剛果紅纖維素培養基初篩、濾紙條降解試驗、酶活測定復篩等構建出一批相對高效的菌系，但是構建復合菌的方法多樣以及不同木質纖維素降解特性不同，還需要更加深入地研究和探討。