甘藍型油菜小孢子培養子葉形胚發育成苗研究

萬麗麗，王轉茸，徐 義，康 雷，楊光圣，辛 強，洪登峰，孫玉宏

（1.武漢市農業科學院作物研究所，武漢 430085；2.華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室，武漢 430070）

1982年德國的Lichter首次報道從甘藍型油菜中成功分離游離小孢子，并利用小孢子培養誘導單倍體繼而加倍獲得雙單倍體（DHs）［1］。基因型、供體材料的生長環境，小孢子發育階段、培養基成分以及不同脅迫處理是影響小孢子細胞胚發生以及再生的關鍵因素［2，3］。研究表明，調整培養基中的滲透壓能提高胚發生，32℃熱激處理小孢子細胞24～72 h能促進胚的再生。熱激處理前將小孢子置于4℃處理24～48 h能增強小孢子的胚發生［4，5］。此外，在誘導培養基中提高蔗糖的濃度、施加活性炭以及秋水仙堿能有效提高小孢子胚再生［6，7］。小孢子培養后得到的胚大多數是球形胚、心型胚或者類似于胚的結構（Embryo-like structures，ELS），只有少數是子葉胚。子葉胚在成苗培養基上能夠快速生長獲得生長勢強、根系發達的植株，通常稱其為高質量胚，而其他類型的胚以及類似于胚的結構轉移到再生培養基上難以一次成苗，甚至褐化死亡。Kim等［8］建立了辣椒小孢子預培養體系，促使250 000個小孢子再生得到294.6個胚。但由于大多數胚是球形胚和類似于胚的結構，必須轉移到再生培養基上才能成苗。這個過程耗時費力，限制了這類胚在育種和遺傳轉化試驗中的應用［9，10］。為能快速獲得子葉胚，研究者對培養基中碳源、生長調節劑、脯氨酸和維生素C含量等因素進行篩選，確定有利于子葉胚發育的因素［11-13］。Irikova等［14］研究認為，小孢子再生得到子葉胚取決于2個關鍵過程，一是小孢子細胞分裂誘導發生過程，二是分裂后繼續向胚發生過程。調節培養基中生長素和細胞分裂素比例能夠協調這2個遞進發育過程［15］。此外，還需要在球形胚階段前應用ABA以及滲透調節物質促進合子胚和體細胞胚的發生［16］。

盡管甘藍型油菜中已經建立了小孢子培養技術體系，并成功應用到重要農藝性狀QTLs定位、小孢子胚遺傳轉化、雙單倍體的育種實踐，但不同基因型油菜小孢子培養獲得子葉胚的能力還是存在很大差別。為探索油菜小孢子培養中高質量子葉胚發生的培養體系，本研究在3個不同基因型的F1雜交組合小孢子培養階段，設置不同培養溫度、培養方式、培養基內生長調節劑和活性炭濃度等處理，篩選評價獲得能產生子葉胚的培養基以及培養方式，以期為甘藍型油菜小孢子培養技術的發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

將3個油菜F1雜交組合6R×ZS11、7DH×ZS11、ZR×R11種植在田間，每個組合種植6行，共計50個單株。蕾薹期噴施葉面肥，提高抗逆能力，預防早衰，防控菌核病。

1.2 方法

1.2.1 小孢子的分離和收集 在田間摘取3個油菜F1雜交組合材料的主花序和分支的花蕾，放入事先鋪上潤濕濾紙的塑料盒中。將塑料盒置于4℃展示柜中1 d，次日選取長度3.0～4.2 mm油菜花蕾，此時雄蕊中的小孢子處于單核晚期至二核小孢子早期，將30～40個花蕾置于50%（V/V）次氯酸鈉溶液中滅菌10 min，之后轉移到無菌ddH2O中浸泡3次，每次10 min。將滅菌處理后的花蕾放入50 mL無菌離心管中，加入10 mL小孢子抽提緩沖液，用研磨棒擠壓花蕾，使得小孢子從雄蕊中釋放到抽提緩沖液中，補充抽提緩沖液定容到40 mL。含有小孢子的抽提緩沖液經過75μm的過濾網過濾，通過過濾網去除研磨后顆粒較大的花蕾組織，收集過濾后的液體，置于控溫15℃離心機中700 r/min離心5 min，保留沉淀物，去除上層液體，加入40 mL抽提緩沖液，輕輕垂懸沉淀中的小孢子細胞，置于控溫15℃離心機中700 r/min再次離心5 min，收集小孢子細胞，用NLNM液體培養基（根據NLN13培養基修改，見表1）輕輕垂懸后沉淀進入下一步試驗。

表1 NLNM培養基組成成分及配制流程

1.2.2 小孢子預培養 將收集得到的小孢子細胞用NLNM液體培養基垂懸后，使用細胞計數儀將小孢子細胞數調整為20×104個/mL，每個直徑為60 mm×20 mm培養皿中加入10～12 mL小孢子懸浮液體，培養皿用Parafilm封口，置于（31±1）℃培養箱中暗培養48 h。

1.2.3 小孢子再生培養 將“1.2.2”步驟中的小孢子液體置于離心溫度為15℃的離心機中500 r/m離心5 min，收集得到的小孢子按照1×104個/mL的密度調整。取調整密度后的小孢子懸浮液5 mL加入到直徑60 mm×15 mm的培養皿中，之后補充10 mL的NLNM液體培養基，培養皿用Parafilm封口，置于塑料容器中，在25℃下暗培養2周。將小孢子懸浮培養液轉移到配制固液雙層培養基的90 mm×15 mm培養皿中繼續生長。固液雙層培養基的組成：上層是NLN13液體培養基，下層是由B5基本培養基+0.1%活性炭+0.25 mg/L 6-BA+3%（m/V）蔗糖+0.5%Phytagel（pH為5.85，高溫滅菌）。為保證小孢子懸浮液能夠均勻分散在上層液體培養基中，上層NLN13液體培養基體積與轉移的小孢子懸浮液的體積為1∶1。小孢子細胞在固-液雙層培養基上置于25℃暗培養2周，其中每1～2周補充NLN13液體培養基5 mL。當胚大小肉眼可見，將含有固-液雙層培養基的培養皿置于23℃暗室內的搖床上培養，轉速為25 r/min。如果再生得到的胚是子葉胚，直接挑選出來轉移到再生培養基，再生培養基的組成成分是B5基本培養基+3%（m/V）蔗糖+0.5%Phytagel的固體培養基。如果再生的胚屬于非子葉胚（球形胚、心型胚或者類似于胚的結構），用滅菌的小勺子將這類胚轉移平鋪到再生培養基上，加入5～10 mL NLN13液體培養基淺層覆蓋胚組織，培養3～4周，每周及時補充NLN13液體培養基保證胚組織處于被淺層覆蓋狀態。

1.2.4 小孢子植株再生 經過4周培養后，將正常的子葉胚（含有胚根、下胚軸以及2片對稱子葉）轉移到再生培養基B5基本培養基+3%（m/V）蔗糖+0.5%Phytagel的固體培養基。在室內培養溫度25℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗，其中每一層的光合作用光子通量密度PPFD為100μmol/（m·s）。在固體培養基中生長6～8周后轉移到土缽中生長。

1.3 數據處理

采用Excel 2010軟件計算平均值，SPSS 13.0軟件進行方差分析，新復數極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 固液雙層培養基與液體培養基上再生胚的比較

統計分析不同品系的小孢子細胞在固液雙層培養基和液體培養基上的出胚數和高質量子葉胚數目的差異（圖1），結果顯示，3個品系在液體培養基中的出胚總數高于固液雙層培養基；3個品系在固液雙層培養中子葉胚數占總出胚數的72.1%、87.0%和85.6%，高于液體培養基上子葉胚數目，并且差異顯著（圖2）。

圖1 在液體培養基和固液雙層培養基上甘藍型油菜小孢子出胚情況

圖2 3個甘藍型油菜品系小孢子在液體以及固液雙層培養基上的出胚數目及子葉胚比率

2.2 不同振蕩周期培養后的出胚類型以及數目的分析

選取60個花蕾分離的小孢子在25℃暗培養2周，之后轉移到固液雙層培養基上。將培養皿置于轉速為25 r/min的搖床上分別培養1周、2周、3周，培養溫度為25℃，統計球型或者心型胚、子葉型胚、類似于胚結構的數目。結果顯示，振蕩培養1周后的子葉型胚數比未振蕩培養的子葉型胚數多，球型或者心型胚的數目顯著減少（圖3）。

圖3 固液雙層培養基上振蕩培養對出胚的影響

2.3 培養溫度與子葉胚產生的相關性分析

將在25℃下暗培養2周的小孢子轉移到不同溫度（25、23、21、19、17℃）下先振蕩培養1周，之后在相應溫度下繼續靜置培養3周，統計出胚總數以及子葉胚數（表2）。結果顯示，隨著培養溫度的降低，平均60個花蕾的出胚總數在降低，在培養溫度從21℃降低到17℃時，出胚總數相比在25℃培養溫度下出胚數目分別減少了47.2%、71.5%、79.1%。對不同培養溫度下子葉胚數目進行統計，結果顯示，在23℃培養條件下正常子葉胚的數目占出胚總數的62.1%，顯著高于其他培養溫度下的子葉胚數目。

表2 不同培養溫度對小孢子胚發育的影響

2.4 固液雙層培養基上不同濃度活性炭對子葉胚數的影響

為提高子葉胚數目，通過設置雙層培養基中固體成分中活性炭的濃度梯度，篩選最優活性炭的濃度（表3）。試驗結果顯示，在添加0.10%活性炭的固液雙層培養基中子葉胚數最多，顯著性高于其他濃度的培養基。

表3 不同濃度活性炭對小孢子出胚數和子葉胚數的影響

2.5 不同濃度6-BA對小孢子出胚的影響

在固液雙層培養基上，添加不同濃度6-BA后統計小孢子出胚數和子葉胚數，結果顯示，在0.256 mg/L 6-BA處理后，平均60個花蕾的出胚總數最多，達到97.2個，顯著高于其他處理濃度下的出胚總數，并且高質量子葉胚數目也最多，與其他處理差異顯著（表4）。

表4 不同濃度6-BA處理下小孢子出胚數和子葉胚數

2.6 不同類型的胚在生根培養基上一次性成苗率分析

將子葉胚轉移到再生培養基B5基本培養基+3%（m/V）蔗糖+0.5%Phytagel的固體培養基，將球型或心型胚以及類似于胚的結構轉移到上述固體培養后加入淺層NLN13培養基，將這類非子葉胚覆蓋。生長4周后統計上述主要3種類型的胚直接轉化成植株，形成次生胚后轉化成植株，形成愈傷組織后轉化成植株以及胚褐化死亡的數目（表5）。結果顯示，3個品系中的子葉胚直接轉化成植株的數目顯著高于球型或心型胚以及類似于胚的結構轉化成植株的數目，在培養基中子葉胚死亡數目顯著低于類似于胚結構的死亡數。

表5 3個甘藍型油菜品系不同類型胚轉化成植株的數量

3 討論與結論

小孢子培養所得到的愈傷和胚進一步成苗的能力取決于培養基的成分。相比液體培養基，在固體培養基上所得到的胚生活力和成苗的能力更強。本研究結果得出，3個F1家系在液體培養基上所得到的胚大多數是球形或者類似于胚的結構，子葉胚數目較少，而在固-液雙層培養基上能夠產生大量的子葉胚。前人采用雙層培養基通常是組成成分相同的液體和固體培養基［17，18］，而本試驗中所配制的雙層培養基中下層的固體成分由B5、活性炭以及6-BA組成，上層液體培養基由NLN13組成，這樣的雙層培養基中子葉胚出胚率高。液體培養基中胚的產量高，而在固體培養基上胚的質量優。Li等［19］研究中發現，將大麥的小孢子細胞在液體培養基上培養3周，將類似于胚的結構轉移到固體培養基上繼續培養3周，再生獲得胚的數目顯著高于在液體培養基上連續培養6周所得數目，并且直徑大于1.5 mm的胚數目多，更容易進一步發育成苗。在本研究中發現，雖然固-液雙層培養基上所得到的胚總數目少于液體培養基，但是子葉胚的數目在總數中所占比率顯著增加。相比固體培養基上培養，小孢子細胞在液體中培養更容易產生愈傷組織，可能是由于液體培養基較好的流動性使小孢子細胞和營養物質緊密接觸的同時，也受到了有害物質或者生長抑制物的干擾，有部分聚集在培養皿底部的胚生長緩慢，甚至死亡［20，21］。為改良小孢子細胞發育的生長環境，可不斷更新液體培養基和降低培養溫度等方法來減少抑制物的產生。小孢子胚發生過程受到乙烯、ACC（乙烯合成的前導物質）以及乙烯利等抑制物質的脅迫，人為施加乙烯合成抑制劑如活性炭能夠促進胚發生［22］。此外，芥菜型油菜小孢子培養中加入PCIB等拮抗乙烯產生的物質后能產生大量的檸檬型胚、香蕉型胚或者飛碟型胚，證明了抑制了乙烯的產生也會抑制子葉的延伸和正常生長。根據小孢子細胞發育的時期，調整合適濃度的活性炭以及PCIB等成分保證了出胚數目和胚的質量［23］。

本研究通過兩步法培養（先液體培養后固液雙層培養）油菜小孢子細胞具有3個方面的優勢：①NLNM液體培養基促進小孢子細胞的胚誘導發生。②在固液雙層培養基上能夠經過固體培養基上的活性炭吸附液體培養基中釋放的有害物質，同時不影響液體培養基對小孢子胚的營養供給；經過振蕩培養起到增氧的作用，固體培養基中添加的6-BA為小孢子胚的發育提供基本的生長調節物質；將液體培養基中小孢子再生的胚轉移到固體培養基上后可以在獲得更多營養的同時稀釋培養液中的有毒物質。③培養小孢子細胞2～3周后降低培養溫度，雖然會抑制胚前發育階段，但是對胚后發育階段有利，有助于小孢子胚從圓形結構向球型胚階段轉化，有效提高胚的質量，同時能夠促進胚向植株的轉變。

綜上所述，本研究中所建立的油菜高質量子葉胚培養的技術體系既能提高出胚數量，同時還能保證子葉胚，提高了小孢子培養獲得雙單倍體的效率。