PRRSV誘導炎癥及氧化應激的研究進展

張文濤，郭艷余，黃金海，張 蕾

（天津大學生命科學學院，天津 300072）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）是引起豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）的病原體［1］。迄今為止，PRRSV主要分為2種基因型：PRRSV-1（歐洲基因型）和PRRSV-2（北美基因型）［2］，分別在1990年和1987年被發現并報道［3］。在中國，自1995年PRRSV首次報道以來，PRRSV-2毒株已占主導地位［4，5］。由于2006年大規模PRRS暴發和高致病性PRRSV（HP-PRRSV）的鑒定，使得PRRSV毒株在中國流行，給國內養豬業造成了巨大的經濟損失［5，6］。2013年以后，PRRSV變異株NADC30－like又給中國養豬業造成了嚴重的打擊［7，8］。PRRSV的傳播途徑主要有以下3種：接觸性傳播（未感染豬接觸含病毒的口鼻分泌物、排泄物等）、精液傳播和空氣傳播［9］，其傳染力和引發的臨床癥狀與病毒的致病性、豬的易感性和表型、微生物的感染壓力和飼養環境有很大關系［10］。PRRSV毒株的基因型重組、變異及混合感染等特性也為其預防和控制帶來了巨大的困難。

PRRSV感染仔豬可以引起嚴重的系統性炎癥、間質性肺炎和發熱等癥狀［11］，而其肺臟組織病理學觀察可見肺泡壁增厚，大量炎性細胞浸潤間質及肺泡中等間質性肺炎的典型特征［12］，說明炎癥反應在PRRSV感染和致病機制等方面扮演著重要的角色。活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）的增加是引起氧化應激的主要原因，也是發炎組織中致病性氧化損傷的標志［13］。有報道指出，氧化應激和炎性細胞因子的過量會導致PRRSV等多種疾病的組織損傷［14］。這表明炎癥和氧化應激反應在PRRSV感染和致病機制等方面起重要作用。因此，研究其致病機制對預防和控制PRRSV給養豬業帶來的損害至關重要，本研究就PRRSV引起炎癥和氧化應激反應的分子機制進行綜述，以期為這方面研究提供參考。

1 PRRSV的基因組結構特征

PRRSV是一種單股正鏈RNA病毒，屬于動脈炎病毒科（Arteriviridae）動脈炎病毒屬（Genusarterivirus）［15］。其基因組長度約15 kb，含有11個開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），分別是ORF1a、

ORF1a′、ORF1b、ORF2、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7，其中ORF1a、ORF1a′和ORF1b編碼4種已知的復制酶多聚蛋白（pp1a、pp1a-nsp2N、pp1a-nsp2TF和pp1ab），這些多聚蛋白會被4種病毒編碼的蛋白酶PLP1α、PLP1β、PLP2和SP共翻譯和翻譯后加工成至少16個不同的非結構蛋白（Non-structural proteins，Nsps）。其結構蛋白（Structural proteins）則僅通過一組亞基因組RNA（Subgenomic RNA，sgRNA）2-7通過共端不連續轉錄策略來翻譯，共含8個開放閱讀框，分別編碼糖蛋白2（Glycoprotein 2，GP2）、未糖基化包膜蛋白（E）、GP3、GP4、GP5、ORF5a蛋白、膜蛋白M和核衣殼蛋白（N）［15］。

2 PRRSV誘導機體的炎癥反應

炎癥反應是機體對微生物感染、外界刺激以及自身組織損傷作出的復雜生物學反應，包括發紅、腫脹、發熱、疼痛以及組織功能受損等一系列癥狀。炎癥反應既能保護機體，也能對機體造成持續性的傷害。這是因為一方面，炎癥反應能夠及時清理病原體和受損的細胞并引發愈合過程；另一方面，不受控制的炎癥反應會引起組織和細胞的各種病變，誘發自身免疫性疾病及其他炎癥性疾病，甚至導致機體死亡。

在炎癥反應過程中，由不同細胞群體（主要是免疫細胞）分泌的炎性細胞因子，因其生物學功能不同，主要分為兩類：促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子，其本質是由免疫細胞分泌的信號蛋白，可以作用于分泌它們的相同細胞（自分泌信號）、鄰近細胞（旁分泌信號）或遙遠的靶細胞（內分泌信號）［16］，促進細胞之間的相互作用和通信［17］。促炎細胞因子，例如白細胞介素IL-1、IL-2、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子TNF-α等刺激炎癥發生，而抗炎細胞因子，例如IL-4、IL-10、IL-13和轉化生長因子（TGF-β）等抑制炎癥反應［18］。通常情況下，促炎介質編碼基因在健康機體不表達，但是如果由外傷、感染或毒素引起的炎癥，會觸發促炎介質編碼基因的表達［18-21］。病毒感染早期屬于急性感染期，機體受到病原刺激后會立即誘導促炎性細胞因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6等的表達以啟動炎癥反應［22］。

2.1 PRRSV通過多條信號通路誘導炎性細胞因子的表達

在很多呼吸道病毒感染中，促炎性細胞因子對于介導炎癥反應激發機體免疫應答必不可少，而PRRSV感染會引起細胞因子風暴，誘導大量促炎性細胞因子的釋放，這是導致PRRSV感染豬后產生嚴重的炎癥反應的原因之一，也被認為是PRRSV發病機理的原因之一［23，24］。PRRSV通過在鼻甲、扁桃體、肺、淋巴結、脾臟、肝臟、腎臟、胸腺、腦、心臟、骨髓和脈絡叢等器官組織中復制，導致促炎細胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等的大量產生，引起呼吸道感染和肺炎等疾病［25-27］。這些促炎性細胞因子在細胞內多條信號通路中起重要作用，表明PRRSV感染可能通過多種不同的信號通路誘導炎性細胞因子的產生。

1）通過Toll樣受體信號通路誘導炎性細胞因子的產生。Jing等［28］研究發現，PRRSV感染原代豬肺泡巨噬細胞（Porcine Alveolar Macrophages，PAMs）后，IL-1β的轉錄和蛋白表達水平均以時間和劑量依賴性方式顯著增加，其中，TLR4-MyD88途徑和其下游信號傳導分子MAPK家族的ERK1/2和p38以及更下游的NF-κB都參與介導了PRRSV感染期間NLRP3的表達和IL-1β的產生（表1），同時宋爽［29］的研究也表明，PRRSV在感染PAM和非洲綠猴腎傳代細胞系Marc-145后，可以通過該信號通路誘導了IL-1β、IL-6和IL-8的產生［29］。Chen等［30］也發現在小膠質細胞中，MyD88-ERK1/2-AP-1信號通路在PRRSV誘導的IL-1β產生中起重要作用。Li等［31］的研究顯示，PRRSV通過TRIF-PKCβ1-TAK1-NF-κB信號通路上調多效炎癥細胞因子IL-15的表達。

表1 細胞信號通路縮略詞

2）通過RIG-I樣受體信號通路誘導炎性細胞因子的產生。Yu等［32］研究發現，PRRSV通過JNKAP-1和NF-κB信號通路誘導IL-12 p40（IL-12的基本亞基）的表達。還有研究人員發現，PRRSV可以通過JNK/AP-1途徑上調IL-8的表達，從而吸引中性粒細胞進入肺，產生炎癥［33，34］。Li等［31］的研究顯示，PRRSV通過MAVS-PKCβ1-TAK1-NF-κB信號通路上調多效炎癥細胞因子IL-15的表達。

2.2 PRRSV多個蛋白誘導炎性細胞因子的表達

研究發現，不同致病性的毒株引起的炎性細胞因子的分泌狀況也是不盡相同的［35］，并且不同病毒蛋白在誘發機體炎癥反應方面也發揮著不同的作用。

1）通過非結構蛋白誘導炎性細胞因子的表達。Fang等［36］的研究顯示，PRRSV（WUH3株）的Nsp2可誘導IκBα降解和NF-κB的核易位并誘導NF-κB依賴性炎性細胞因子，如IL-6、IL-8等，也可能參與病毒對宿主細胞TNF-α反應的調節［37］，同時寧娟［38］的研究也證明了Nsp2在Marc-145細胞中的表達能激活IL-8，但具體的結構域未確定。Ying等［24］發現，PRRSV強毒株VR-2385的Nsp12能夠通過p38/MAPK途徑誘導STAT1的727位絲氨酸磷酸化水平升高以及IL-1β和IL-8的表達。PRRSV感染還會導致IL-10劑量依賴性表達，其表達與NF-kB信號通路和p38/MAPK通路相關［39，40］，PRRSV感染豬后會導致抗炎性細胞因子IL-10升高，并通過炎性細胞浸潤誘導肺部病變［41，42］，而PPRSV的Nsp11和Nsp5是IL-10的強誘導劑，可誘導較強的IL-10反應［43，44］。

2）通過結構蛋白誘導炎性細胞因子的表達。寧娟［38］的研究顯示，PRRSV的結構蛋白N蛋白的30～73氨基酸區域對Marc-145細胞中IL-8的激活和表達有作用。PRRSV感染還會導致IL-10劑量依賴性表達，其表達與NF-kB信號通路和p38/MAPK通路相關［39，40］，其結構蛋白N和GP5可顯著激活IL-10的啟動［43］。綜上所述，PRRSV誘導機體產生炎癥反應的機制如圖1所示。

圖1 PRRSV誘導機體產生炎癥反應的機制

3 PRRSV誘導機體的氧化應激反應

氧化應激是指機體在遭受外來有害刺激時，體內高活性分子如ROS和活性氮自由基（Reactive nitrogen species，RNS）產生過多，而細胞無法清除過載的氧化物，致使中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，氧化中間產物增加，最終導致細胞組織形成損傷［45］。氧化應激是自由基在體內產生的一種負向調節作用，并被認為是導致衰老和疾病的一個重要因素［45，46］。病毒感染會引起細胞ROS的釋放，過量的ROS會使生物膜磷脂層發生脂質過氧化反應，從而產生丙二醛（Malondialdehyde，MDA）等代謝產物，激發細胞產生氧化應激反應，因此，ROS可以調節宿主的炎癥和免疫反應，也被認為是病毒感染過程中引起細胞氧化應激和氧化損傷的主要原因［47］。但是ROS在病毒性疾病病理進程中也能激活機體免疫系統，在病毒清除和免疫導致的細胞損傷方面起到正面的調節作用［48］。

1）PRRSV通過調控ROS相關通路導致氧化應激。病毒感染期間氧化還原平衡的變化與病毒的發病機制有關［49］，PRRSV作為一種RNA病毒，也可導致豬產生氧化應激反應［50，51］，并且張浩等［52］的研究表明，在高致病性PRRSV感染Marc-145細胞過程中，會使細胞產生氧化應激反應，并且是通過ROS的產生來誘導氧化應激［53，54］，而ROS的上調與線粒體功能障礙有關［54］，也可能歸因于細胞中誘導型一氧化氮合酶（Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）升高，而iNOS的升高與較高的熱休克蛋白90（HSP90）表達和較低的微囊蛋白1（Cav-1）表達有關［55］。線粒體ROS的產生還和PRRSV誘導的Marc-145細胞凋亡性死亡有關［13］，宿主細胞的凋亡誘導在PRRSV感染的發病機理中起重要作用［56］。而與PAM相比，PRRSV感染的單核細胞衍生的巨噬細胞（Monocytederived macrophages，MDMs）中產生了更高水平的ROS和促凋亡基因的表達［57］。ROS還可以攻擊生物膜上的多種不飽和脂肪酸，引起脂質過氧化作用，從而誘導諸如NF-κB活化等細胞作用［58，59］。同時Yan等［51］的研究發現，PRRSV感染Marc-145細胞之后會產生ROS并直接激活NF-κB，或通過激活某種細胞信號途徑產生ROS，導致IkBα的降解以及隨后NF-κB的激活。

2）PRRSV通過抑制抗氧化酶活性導致氧化應激。ROS調節細胞對病毒復制的允許性［60］，在PRRSV感染的豬中觀察到了谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）的降低［61］，這表明PRRSV感染后會通過抑制抗氧化酶活性導致氧化應激。有研究表明，PRRSV可以下調Marc-145細胞、PAM細胞和受感染豬的肺組織中超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）的表達，降低谷胱甘肽的表達，并增加ROS和MDA的產生［62］。這些結果表明，PRRSV誘導的氧化應激環境可能對于其病毒復制是有益的。而細胞內經典的抗氧化途徑，NRF2-ARE信號通路可以通過促進NADPH脫氫酶醌-1（NADPH Dehydrogenase Quinone-1，NQO1）和SOD等抗氧化酶的分泌，維持適當的氧化還原狀態，也會從另一方面抑制PRRSV感染引起的組織損傷和氧化應激反應，保護細胞和機體穩態［62］。在感染了PRRSV的PAM細胞和小膠質細胞中也檢測到了ROS的上調，他們的產生還增加了這些細胞在細胞因子水平上的炎癥反應［63］，氧化應激是病毒感染過程中非常重要的一環，病毒感染過程中也會通過炎癥性細胞因子（如TNF-α或IL-1）促進ROS產生，之后ROS激活NF-κB進而誘導SOD的過度表達，來降低線粒體中的氧化還原狀態的平衡［64］。這說明PRRSV誘導的炎癥和氧化應激反應之間存在復雜的關系，值得深入研究。

4 展望

盡管在過去的30年中，研究人員對PRRSV引起的炎癥發病機理的分子機制取得了一些進展，但是針對其誘導的氧化應激反應的分子機制卻研究較少。病毒感染后產生的ROS可在機體內引起氧化應激并引起巨噬細胞對炎性細胞因子（如TNF-α和IL-1等）的釋放，從而造成廣泛的損傷作用，加重疾病進程［65］，而ROS清除劑可顯著消除促炎性細胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8）的活化，這表明ROS對于促炎性基因的產生也至關重要［63］。宋爽［29］的研究也發現，ROS也參與PRRSV感染誘導的IL-1β、IL-6和IL-8的產生。而感染豬肺部的旁觀者效應是由于病毒引起的促炎性細胞因子和趨化因子的異常和持續分泌，這導致了吞噬細胞釋放的ROS的過量產生［66］。這也為研究PRRSV誘導產生的炎癥和與氧化應激之間的復雜關系提供了線索。